不同提取方法對(duì)軟棗獼猴桃多糖單糖組成及抗氧化活性的影響

宣 麗，劉長江

沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，沈陽 110866

軟棗獼猴桃［Actinidia arguta(Sieb.et Zucc.)Planch.ex Miq.］別名軟棗子、獼猴梨、藤梨，是獼猴桃科、獼猴桃屬多年生落葉藤本植物。在我國分布于東北、華北、山東、西北及長江流域，其中，東北南部山區(qū)較多見［1］。軟棗獼猴桃以其耐寒性而著稱，果實(shí)很小，如棗般大，表皮光滑無毛，可直接食用，甜酸比適中，風(fēng)味極佳［2］。它富含多種營養(yǎng)成分，如高VC含量(200～400 mg/100 g)、高活性的蛋白酶、種類齊全的微量元素［3］、豐富的不飽和脂肪酸含量［4］等。其果實(shí)、種子及根莖均可入藥［5］，是理想的綠色食品和食療食品。多糖是軟棗獼猴桃中主要成分之一，對(duì)其進(jìn)行深入研究對(duì)于軟棗獼猴桃的開發(fā)利用有重要意義。本文以軟棗獼猴桃鮮果為原料，采用高溫、低溫和微波三種不同方法提取多糖，然后對(duì)其單糖組成及抗氧化活性進(jìn)行研究，以期為軟棗獼猴桃多糖的構(gòu)效分析提供一定的試驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

軟棗獼猴桃鮮果，采自遼寧省撫順山區(qū);1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)購自Sigma公司;單糖標(biāo)準(zhǔn)品:鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、葡萄糖醛酸(GlcA)及半乳糖醛酸(GalA)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;乙腈、甲醇為色譜純;其余試劑為國產(chǎn)分析純。

U-2910型紫外可見分光光度計(jì)(日立先端科技股份有限公司);Heto-LL3000凍干機(jī)(賽默飛世爾科技公司);TSQ-280搖床(上海精宏儀器有限公司);HC23B-AV型微波爐(上海新儀微波化學(xué)科技有限公司);HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市杰瑞爾電器有限公司);5805型高速冷凍離心機(jī)(德國艾本德公司);RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);Waters高效液相色譜儀(美國Waters公司);C18色譜柱(賽默飛世爾科技公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 軟棗獼猴桃多糖的制備

準(zhǔn)確稱取300 g軟棗獼猴桃鮮果，洗凈破碎后，采用確定的乙醇除雜工藝:乙醇濃度80%，浸泡時(shí)間60 min，料液比 1∶2(g∶mL)，去除軟棗獼猴桃果中大量的色素類雜質(zhì)及還原糖，抽濾，棄去上清液，沉淀部分稱重后平均分成3份，一份采用高溫水提工藝:水浴溫度100℃、料液比1∶9(g∶mL)、水浴時(shí)間2 h;一份采用低溫水提工藝:搖床溫度40℃、料液比 1∶9(g∶mL)、振搖時(shí)間 2 h、轉(zhuǎn)速 180 rpm;一份采用微波輔助提取工藝:料液比1∶9(g∶mL)、微波功率500 W、微波處理時(shí)間10 min，提取結(jié)束后，離心獲得的上清液分別進(jìn)行減壓濃縮，然后用4倍體積的無水乙醇沉淀，4℃冷藏過夜，沉淀離心后依次用石油醚、丙酮、無水乙醇浸泡洗滌，抽濾后冷凍干燥，分別得高溫提取的軟棗獼猴桃多糖AAP-1、低溫提取的軟棗獼猴桃多糖AAP-2、微波提取的軟棗獼猴桃多糖AAP-3，根據(jù)公式:多糖得率/%=多糖質(zhì)量/鮮果質(zhì)量×100，分別計(jì)算三種方法提取的軟棗獼猴桃多糖的得率。

2.2 不同方法提取的軟棗獼猴桃多糖理化性質(zhì)的比較

精確稱取 AAP-1、AAP-2、AAP-3 各 0.5 g，用 80 mL蒸餾水復(fù)溶，溶液用布氏漏斗抽濾，濾液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻后得質(zhì)量濃度為5 mg/mL的多糖溶液。通過碘-碘化鉀試劑檢測(cè)軟棗獼猴桃多糖中是否含有淀粉;三氯化鐵試劑檢測(cè)是否含有酚羥基;斐林試劑檢測(cè)是否含有還原糖;咔唑-硫酸試劑檢測(cè)是否含有糖醛酸;紫外吸收280 nm檢測(cè)是否含有蛋白質(zhì)［6］。

2.3 不同方法提取的軟棗獼猴桃多糖的單糖組成分析

2.3.1 軟棗獼猴桃多糖水解

精確稱取不同方法提取的軟棗獼猴桃多糖樣品40 mg于具塞試管中，分別加入2 mol/L的H2SO4溶液4 mL，于100℃水浴鍋中水解2 h，冷卻至室溫，反應(yīng)混合物3000 rpm離心5 min，取上清液2 mL用6 mol/L的NaOH溶液中和到pH約為7，溶液用于PMP衍生化。

2.3.2 單糖衍生物的制備［7］

精密吸取濃度為4 mmol/L的單糖對(duì)照品、單糖混合液及軟棗獼猴桃多糖水解液各250 μL，于具塞試管中，依次加入0.5 mol/L PMP甲醇溶液250 μL和0.3 mol/L 的氫氧化鈉溶液 250 μL，混勻，置于70℃水浴反應(yīng)30 min，取出，冷卻至室溫，加入0.3 mol/L的鹽酸250 μL進(jìn)行中和，加入1 mL氯仿萃取，充分震蕩后，小心用注射器吸棄下層有機(jī)相，重復(fù)3次，上層為水相，加入去離子水400 μL稀釋混勻，然后經(jīng) 0.45 μm 微孔濾膜濾過，20 μL 進(jìn)樣分析。

2.3.3 HPLC 分析方法

采用Waters色譜系統(tǒng)。檢測(cè)波長為250 nm;柱溫為室溫;流速1.0 mL/min;流動(dòng)相:溶劑 A:0.05 mol/L磷酸緩沖液(KH2PO4-NaOH，pH6.9);溶劑B:乙腈;梯度洗脫模式:0→5→10→15 min對(duì)應(yīng):17%→20%→23%→26%(B);進(jìn)樣體積20 μL。

2.4 不同方法提取的軟棗獼猴桃多糖體外抗氧化活性的測(cè)定

2.4.1 總還原力的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)［8］。精確量取 0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL 軟棗獼猴桃多糖溶液(5 mg/mL)于6支具塞試管中，再分別加入蒸餾水至總體積為1 mL，搖勻后依次加入 2.5 mL 0.2 mol/L pH值6.6磷酸緩沖溶液和2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液，于50℃水浴中保溫20 min后快速冷卻，再加入2.5 mL 10%三氯醋酸溶液，以4000 rpm離心10 min，取上清液加入0.5 mL 0.1%的三氯化鐵溶液，振蕩搖勻，靜置10 min后在700 nm處測(cè)其吸光值，以空白管調(diào)零點(diǎn)，比較不同樣品的總還原力。

2.4.2 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)［8］。精確量取 0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL 軟棗獼猴桃多糖溶液(5 mg/mL)于6支具塞試管中，再分別加入蒸餾水至總體積為1 mL，搖勻后分別加入0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液3 mL，混勻后置暗處，室溫反應(yīng)30 min后，以蒸餾水調(diào)零點(diǎn)，在517 nm處測(cè)定空白管的吸光值A(chǔ)c、樣品管的吸光值A(chǔ)s，Vc為陽性對(duì)照。半抑制濃度IC50，根據(jù)濃度-清除率二維曲線上讀取的清除率為50%時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度值計(jì)算，按公式:清除率/%=(Ac-As)/Ac×100，計(jì)算DPPH自由基的清除率。

2.4.3 羥基自由基(·OH)清除能力的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)［8］。精確量取 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 軟棗獼猴桃多糖溶液(5 mg/mL)于6支具塞試管中，再分別加入蒸餾水至總體積為1 mL，搖勻后分別加入10 mmol/L的FeSO41 mL，10 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液1mL，最后加入8.8 mmol/L的H2O21 mL啟動(dòng)反應(yīng)，37℃反應(yīng)30 min，在510 nm下測(cè)定空白管的吸光值A(chǔ)c、樣品管的吸光值A(chǔ)s，Vc為陽性對(duì)照。半抑制濃度IC50，根據(jù)濃度-清除率二維曲線上讀取的清除率為50%時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度值計(jì)算，按公式:清除率/%=(Ac-As)/Ac×100，計(jì)算羥基自由基的清除率。

2.4.4 超氧陰離子自由基(O2-·)清除能力的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)［8］。精確量取 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 軟棗獼猴桃多糖溶液(5 mg/mL)于6支具塞試管中，再分別加入蒸餾水至總體積為1 mL，搖勻后分別加入4.5 mL 50 mmol/L pH=8.2的Tris-HC1緩沖液，混勻，于25℃恒溫水浴中保溫20 min，取出后立即加入25 mmol/L鄰苯三酚溶液0.3 mL，迅速搖勻后于25℃恒溫水浴中反應(yīng)5 min，加入8 mmol/L HCl 1 mL，終止反應(yīng)，于320 nm處測(cè)定空白管的吸光值A(chǔ)c、樣品管的吸光值A(chǔ)s，Vc為陽性對(duì)照，按公式:清除率/%=(Ac-As)/Ac×100，計(jì)算超氧陰離子自由基的清除率。

3 結(jié)果與討論

3.1 不同方法提取的軟棗獼猴桃多糖的得率及理化性質(zhì)的比較

表1 AAP-1、AAP-2及AAP-3的得率及理化性質(zhì)比較Table 1 Yield，physical and chemical characteristics of AAP-1，AAP-2 and AAP-3

由表1可知，三種方法提取的軟棗獼猴桃多糖均為白色，表明其中的色素類雜質(zhì)在乙醇除雜、乙醇沉淀、不同極性溶劑的洗滌過程中已全部除去;三種多糖中均未檢測(cè)到酚羥基和還原糖，但都含有一定數(shù)量的糖醛酸和蛋白質(zhì)。AAP-1的得率最高，但其中檢測(cè)到淀粉;AAP-2得率最低，其中未檢測(cè)到淀粉;AAP-3的得率略低于AAP-1，但該法的提取時(shí)間為10 min，遠(yuǎn)低于高溫提取的2 h，并且其中未檢測(cè)到淀粉。綜上所述，低溫處理不利于軟棗獼猴桃中多糖的溶出，該法得率最低;高溫長時(shí)處理可以使軟棗獼猴桃中的淀粉溶出;微波輔助提取法可以使軟棗獼猴桃多糖在短時(shí)間內(nèi)大量溶出，而且其中不含淀粉，提取效率最高。

3.2 不同方法提取的軟棗獼猴桃多糖的單糖組成

圖1分別給出了混標(biāo)、AAP-1、AAP-2及AAP-3的PMP衍生物的高效液相色譜圖。各峰的出峰時(shí)間和所代表的化合物如表2所示。

圖1 混標(biāo)、AAP-1、AAP-2、AAP-3水解衍生物的色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of the PMP derivatives of monosaccharide standard，AAP-1，AAP-2 and AAP-3

由圖1、表2可知，通過硫酸水解、PMP柱前衍生測(cè)定軟棗獼猴桃多糖的單糖組成，結(jié)果表明不同方法提取的軟棗獼猴桃多糖均由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖7種單糖組成，但各單糖的含量有顯著差異，其中差異最為顯著的是葡萄糖和半乳糖醛酸，用面積歸一法計(jì)算［9］，各單糖的摩爾百分含量如表3所示。

表2 標(biāo)準(zhǔn)單糖及AAP-1、AAP-2、AAP-3水解衍生物的保留時(shí)間(min)Table 2 Retention time of standard monosaccharide and AAP-1，AAP-2，AAP-3 hydrolysate derivatives(min)

表3 AAP-1、AAP-2、AAP-3單糖組成的差異Table 3 The difference of monosaccharide composition ratio of AAP-1，AAP-2 and AAP-3

由表3可知，AAP-1、AAP-2、AAP-3三種多糖中葡萄糖的摩爾百分含量差異顯著，半乳糖醛酸的摩爾百分含量依次升高。AAP-1葡萄糖的摩爾百分含量最高，可達(dá)到94.72%，這可能是AAP-1中含有淀粉的緣故;AAP-2葡萄糖的摩爾百分含量顯著降低，僅為9.89%，半乳糖和阿拉伯糖的摩爾百分含量顯著升高，半乳糖醛酸和甘露糖的摩爾百分含量也有所上升，表明AAP-2中含有果膠多糖;AAP-3葡萄糖的摩爾百分含量較AAP-2有所上升，但遠(yuǎn)低于AAP-1，為21.97%，半乳糖醛酸的摩爾百分含量繼續(xù)升高，達(dá)到16.05%，阿拉伯糖的摩爾百分含量較AAP-2下降明顯，其余四種單糖的摩爾百分含量與AAP-2相差不大，表明AAP-3中含有大量的果膠多糖。

3.3 不同方法提取的軟棗獼猴桃多糖抗氧化活性的測(cè)定

3.3.1 總還原力的測(cè)定

圖2 AAP-1、AAP-2、AAP-3 的總還原力Fig.2 Reducing power of AAP-1，AAP-2 and AAP-3

據(jù)報(bào)道，抗氧化活性與總還原力之間存在極大的相關(guān)關(guān)系［8］。由圖 2 可以看出，AAP-1、AAP-2、AAP-3均具有一定的還原力，并且呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性關(guān)系。其中AAP-3的總還原力最強(qiáng)，AAP-2次之，AAP-1的總還原力最弱。

3.3.2 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

圖3 AAP-1、AAP-2、AAP-3對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定Fig.3 DPPH·-scavenging rate of AAP-1，AAP-2 and AAP-3

由圖3可知，AAP-1、AAP-2、AAP-3都對(duì) DPPH·有一定的清除作用，而且在0.5～4mg/mL濃度范圍內(nèi)隨著濃度的升高清除率逐漸增大，呈現(xiàn)量-效關(guān)系。經(jīng)計(jì)算，AAP-1、AAP-2、AAP-3的 IC50分別為:3.7、3.2、1.2 mg/mL，表明 AAP-3 清除 DPPH·的效果明顯高于 AAP-1和 AAP-2，當(dāng) AAP-3濃度為4 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH·的清除率可以達(dá)到94%，但Vc的IC50僅為0.03 mg/mL，AAP-3與其相比還有很大差距。

3.3.3 羥基自由基(·OH)清除能力的測(cè)定

圖4 AAP-1、AAP-2、AAP-3對(duì)羥基自由基清除能力的測(cè)定Fig.4 ·OH scavenging rate of AAP-1，AAP-2 and AAP-3

由圖4可知，隨著軟棗獼猴桃多糖濃度的升高，其對(duì)羥基自由基的清除率逐漸增大，呈現(xiàn)量-效關(guān)系。但AAP-1清除羥基自由基的能力明顯弱于AAP-2和AAP-3，當(dāng) AAP-1濃度為5 mg/mL時(shí)，對(duì)羥基自由基的清除率僅為12.8%。AAP-2、AAP-3的 IC50分別為:3.8、2.7 mg/mL，表明 AAP-3 的清除效果優(yōu)于 AAP-2，Vc的 IC50為0.2 mg/mL，AAP-3 與其相比也存在較大差距。

圖5 AAP-1、AAP-2、AAP-3對(duì)超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定Fig.5 O2-·scavenging rate of AAP-1，AAP-2 and AAP-3

由圖5可知，軟棗獼猴桃多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力很弱，AAP-3的清除能力相對(duì)較強(qiáng)，但當(dāng)多糖濃度達(dá)到5 mg/mL時(shí)，清除率也只有8.2%。

綜上所述，軟棗獼猴桃多糖具有較強(qiáng)清除DPPH自由基和羥基自由基的能力，但清除超氧陰離子自由基的能力很弱。結(jié)合理化性質(zhì)和單糖組成的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn):三種多糖的最大差別在于糖醛酸的含量，并且推測(cè)這一差別可能直接導(dǎo)致三種多糖在抗氧化活性方面的差異，因?yàn)橛醒芯勘砻魈侨┧岬暮繉?duì)果膠多糖的功能特性起著決定性的作用［10］，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)需對(duì)微波輔助提取的軟棗獼猴桃多糖進(jìn)行深入研究，以確定其活性組分及相關(guān)結(jié)構(gòu)特征。

4 結(jié)論

采用高溫水提工藝、低溫水提工藝和微波輔助提取工藝得到的三種軟棗獼猴桃多糖均為白色，都不含酚羥基和還原糖，但都含有一定數(shù)量的糖醛酸和蛋白質(zhì)。AAP-1含有淀粉;AAP-2、AAP-3不含淀粉;三種多糖均由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖7種單糖組成，AAP-1因含有淀粉，葡萄糖的摩爾百分含量最高，AAP-2和AAP-3為果膠多糖，含有較多的甘露糖、半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖;AAP-3的抗氧化活性最強(qiáng)，AAP-2次之，AAP-1最弱。本文對(duì)軟棗獼猴桃多糖的單糖組成分析及抗氧化活性測(cè)定為軟棗獼猴桃在食品、醫(yī)藥和保健方面的開發(fā)應(yīng)用提供可靠的科學(xué)依據(jù)。

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