β-環(huán)糊精包合揮發(fā)油和丹皮酚的工藝研究

谷 雨，潘書洋，李超生，王 晶，于薔薔，李 喆，華 山

1吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長春 130118;2吉林省食品藥品檢驗(yàn)所，長春 130033;3吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，長春 130012;4延邊大學(xué)，延吉 133000

益氣補(bǔ)腎活血膠囊是治療認(rèn)知功能障礙的復(fù)方新藥，處方是由“人參、石菖蒲、牡丹皮、三七”等七味藥組成。目前中醫(yī)學(xué)者們將認(rèn)知功能障礙歸屬于“健忘”、“善忘”的范疇。當(dāng)前研究表明，認(rèn)為輕度認(rèn)知障礙與以往研究者對老年癡呆病因病機(jī)的認(rèn)識相似，本病以臟腑虛衰、腎心虧虛為本，痰濁血瘀為標(biāo)。有眾多學(xué)者采用補(bǔ)腎益心、健脾益氣、祛痰活血通絡(luò)等方藥及針刺治療［1］，本處方也是針對這幾方面進(jìn)行治療。根據(jù)文獻(xiàn)報道［2，3］，石菖蒲中的揮發(fā)油和牡丹皮中的丹皮酚對認(rèn)知功能障礙有治療作用，是治療的有效部位或有效成分。臨床廣泛用于癲病、痰厥、熱病神昏、健忘、中風(fēng)失語、耳鳴、老年性癡呆等疑難病癥［4］。

石菖蒲揮發(fā)油和丹皮酚易揮發(fā)，常規(guī)的水煎工藝會導(dǎo)致其損失，為了更好地發(fā)揮其藥效作用，本實(shí)驗(yàn)將處方中石菖蒲提取揮發(fā)油的工藝和牡丹皮提取丹皮酚的工藝進(jìn)行優(yōu)選，在此基礎(chǔ)上，對所得到的石菖蒲揮發(fā)油和丹皮酚用環(huán)糊精包合，本實(shí)驗(yàn)在考察包合方法時，以揮發(fā)油的利用率為考察指標(biāo)進(jìn)行考察，在選擇的包合方法基礎(chǔ)上，考慮處方中的丹皮酚也容易揮發(fā)，易造成藥品質(zhì)量的下降，所以把丹皮酚也與石菖蒲揮發(fā)油一起包合。因?yàn)閾]發(fā)油的成分比較復(fù)雜，不容易檢測，而丹皮酚的含量相對可控，所以在考察包合工藝時選用液相法測包合物中丹皮酚的含量，得到最佳的包合工藝，保證藥材的合理應(yīng)用和藥品的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-10AT高效液相色譜儀，SPD-10Avp紫外檢測器;CX-250超聲波清潔器(北京醫(yī)療設(shè)備二廠);FA604A型電子天平(上海精天電子儀器有限公司);101A-1ET電熱鼓風(fēng)干燥箱。

1.2 試藥

揮發(fā)油、丹皮酚(自制);β-環(huán)糊精，上海惠世生化試劑有限公司;無水乙醇，北京化工廠;丹皮酚對照品購自中國藥品生物制品檢定所，批號:110708-200505;甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 包合方法的比較［5，6］

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，對研磨法和水飽和溶液法兩種包合方法進(jìn)行比較。

2.1.1 水飽和溶液法

稱取β-環(huán)糊精6.0017 g，置于磨口錐形瓶中，加蒸餾水制成飽和溶液利用磁力攪拌器攪拌，溫度為35℃，用膠頭滴管逐滴加入揮發(fā)油乙醇溶液1 mL，攪拌1 h后將所得產(chǎn)物冷藏過夜，次日抽濾，先用水洗滌3次，每次10 mL，再用無水乙醇洗滌數(shù)次，多次少量共約7 mL，放入40℃烘箱4 h，即得終產(chǎn)物。

2.1.2 研磨法

稱 β-環(huán)糊精6.0016 g，置于研缽中，加入20 mL蒸餾水，沿同一方向研磨均勻，使溶液成糊狀，用膠頭滴管逐滴加入揮發(fā)油乙醇溶液1 mL，研磨1 h，再置于冰箱冷藏過夜。次日抽濾，洗滌，先用30 mL水多次少量沖洗，再用無水乙醇7 mL沖洗，產(chǎn)物于烘箱40℃干燥4 h，即得終產(chǎn)物。

2.1.3 包合物中揮發(fā)油含油率及油利用率

按照藥典揮發(fā)油測定法第二法測定，將所得干燥包合物精密稱重，利用揮發(fā)油提取器提取5 h，至油量不再增加時停止加熱，充分靜置讀數(shù)，計算包合物中揮發(fā)油含油量及油利用率，公式如下:

表1 包合方法比較Table 1 Comparison of inclusion methods

從表1可知，研磨法含油量為0.71 mL，水飽和溶液法含油量為0.39 mL，表明研磨法制備石菖蒲揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物，其揮發(fā)油利用率較高，故后續(xù)試驗(yàn)采用研磨法。

2.2 包合物的制備

按照正交試驗(yàn)表，稱取規(guī)定量的β-環(huán)糊精，加規(guī)定體積水研磨，再加入規(guī)定量以無水乙醇稀釋的揮發(fā)油(0.5 mL)和丹皮酚(0.4 g)，共同研磨至規(guī)定時間，放入4℃冰箱冷藏過夜，次日過濾，加規(guī)定體積無水乙醇，洗滌包合物，包合物低溫(40℃)烘干，放置備用。

2.3 丹皮酚含量測定

2.3.1 色譜分析條件

儀器型號:島津LC-10AT高效液相色譜儀;色譜柱為 Diamonsil C18(250 mm × 4.5 mm，5 μm);檢測波長:274 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫為室溫;流動相:50%甲醇。

2.3.2 對照品溶液制備

精密稱取丹皮酚對照品5.76 mg，置于100 mL容量瓶中，加甲醇定容。

2.3.3 供試品溶液制備

取適量的包合物，置于50 mL容量瓶中，加入30 mL甲醇超聲30 min，放冷后用甲醇定容。過濾，收集續(xù)濾液，即得。

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

精密量取對照品溶液 2、4、8、10、16 μL，分別進(jìn)樣。按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測定，測得丹皮酚峰面積。以對照品量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)回歸處理，得回歸方程為:Y=134750X-15695，相關(guān)系數(shù) r=0.9995。結(jié)果表明丹皮酚在0.115～0.922 μg范圍內(nèi)，峰面積與樣品量有良好的線性關(guān)系。

2.3.5 精密度試驗(yàn)

精密吸同一供試液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 μL。測得丹皮酚平均峰面為2284514.04，計算其 RSD 為1.33%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸同一供試品溶液，分別于制備后0、2、4、6、12、24 h，按“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件，各進(jìn)樣 10 μL，測得丹皮酚平均峰面積為2115559.00，計算其RSD為0.76%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批包合物，共取5份，各約0.08 g，按供試品溶液的配制方法制備樣品，按“2.3.1”色譜條件進(jìn)行測定，每次進(jìn)樣10 μL，測得丹皮酚的平均含量為4.97%(n=5)，RSD 為1.98%，表明該方法具有較好的重復(fù)性。

2.3.8 回收率試驗(yàn)

取同一批包合樣品(包合物中丹皮酚含量為4.966%)約0.04 g，精密稱定5份，分別精密加入丹皮酚對照品約2.5 mg，按照方法制備供試品溶液，按色譜條件進(jìn)行測定，每次進(jìn)樣10 μL，測得丹皮酚平均回收率為99.67%，RSD為0.85%。

表2 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Recovery test results

2.4 β-環(huán)糊精包合揮發(fā)油和丹皮酚預(yù)實(shí)驗(yàn)

2.4.1 β-環(huán)糊精包合揮發(fā)油和丹皮酚用量比對包合工藝的影響

分別稱取β-環(huán)糊精4 g(β-環(huán)糊精∶丹皮酚∶揮發(fā)油 =4∶0.4∶0.5)、8 g(β-環(huán)糊精∶丹皮酚∶揮發(fā)油 =8∶0.4∶0.5)、10g(β-環(huán)糊精∶丹皮酚∶揮發(fā)油 =10∶0.4∶0.5)三份，每份加入3倍量的水，沿同一方向研磨均勻，使溶液成糊狀，用膠頭滴管逐滴加入揮發(fā)油、丹皮酚乙醇溶液，研磨1.5 h，再置于冰箱冷藏過夜。次日抽濾，先用30 mL水多次少量沖洗，再用無水乙醇5 mL沖洗，產(chǎn)物于烘箱40℃干燥4 h，將制得的包合物依法測定其包合率。結(jié)果如圖1，隨著β-環(huán)糊精與揮發(fā)油和丹皮酚比例的增加，包合率呈現(xiàn)增長趨勢，當(dāng)β-環(huán)糊精達(dá)到8g時，飽和率達(dá)到最大，因此選用 4、6、8 g β-環(huán)糊精進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖1 β-環(huán)糊精包合揮發(fā)油和丹皮酚用量比對包合工藝的影響Fig.1 Effect of amount of β-cyclodextrin on inclusion rate

2.4.2 加水量與β-環(huán)糊精用量比對包合工藝的影響

稱取β-環(huán)糊精三份，每份8 g，分別加入2倍、3倍、4倍水，其余操作同2.4.1項(xiàng)，制得的包合物測定其包合率。結(jié)果如圖2，在加入3倍量水時，包合率達(dá)到最大，加2倍水時，不能充分使β-環(huán)糊精攪拌均勻。因此選用3倍、4倍、5倍加水量進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖2 加水量與β-環(huán)糊精用量比對包合工藝的影響Fig.2 Effect of ratio of water/β-cyclodextrin on inclusion rate

2.4.3 研磨時間對包合工藝的影響

稱取β-環(huán)糊精三份，每份8 g，分別加入3倍量水，沿同一方向研磨均勻，使溶液成糊狀，用膠頭滴管逐滴加入揮發(fā)油、丹皮酚乙醇溶液，研磨0.5、1、1.5 h，其余操作同 2.4.1項(xiàng)，制得的包合物測定其包合率。結(jié)果如圖3，研磨時間越長其包合效果越好，因此正交試驗(yàn)中選用1、1.5、2 h三個水平。

圖3 研磨時間對包合工藝的影響Fig.3 Effect of grinding time on inclusion rate

2.4.4 無水乙醇沖洗量對包合工藝的影響

在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，無水乙醇沖洗量對丹皮酚的包合率也有影響，因此，將無水乙醇沖洗量也作為考察因素。稱取β-環(huán)糊精8 g，每份加入3倍量的水，沿同一方向研磨均勻，使溶液成糊狀，用膠頭滴管逐滴加入揮發(fā)油、丹皮酚乙醇溶液，研磨1.5 h，再置于冰箱冷藏過夜。次日抽濾，先用30 mL水多次少量沖洗，再用5、10、15 mL無水乙醇沖洗，產(chǎn)物于烘箱40℃干燥4 h，將制得的包合物依法測定其包合率。結(jié)果如圖4，5 mL無水乙醇沖洗包合率最高，增加無水乙醇用量，包合率減少，小于5 mL時，無水乙醇無法將包合物全部覆蓋。

2.5 正交試驗(yàn)提取因素與水平設(shè)計方案

圖4 無水乙醇沖洗量對包合工藝的影響Fig.4 Effect of volume of washing anhydrous ethanol on the inclusion rate

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以丹皮酚的包合率為指標(biāo)，選擇β-環(huán)糊精、丹皮酚和揮發(fā)油比例、加水量、研磨時間無水乙醇沖洗量作為考察因素。用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計優(yōu)選，測定出包合物中丹皮酚的含量，計算丹皮酚的包合率。其因素和水平見表3，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4，方差分析見表5。

表3 包合工藝考察因素及水平Table 3 The factor-level table of orthogonal design

按正交表L9(34)正交表進(jìn)行安排試驗(yàn)，每次試 驗(yàn)均重復(fù)1次。

表4 包合工藝L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Orthogonal design and results of inclusion procedure

表5 包合工藝方差分析Table 5 Variance analysis of inclusion procedure

通過方差分析表可以看出，A和D均具有顯著性，并且 A3＞A2＞A1，B1＞B2＞B3，C3＞C2＞C1，D1＞D2＞D3，最佳工藝為 A3B1C3D1即 β-環(huán)糊精∶丹皮酚(0.4g)∶揮發(fā)油(0.5 mL)=8∶0.4∶0.5 加入 3 倍β-環(huán)糊精量的水研磨，研磨2 h，用5 mL(0.5 mL揮發(fā)油，0.4 g丹皮酚時)無水乙醇沖洗。

2.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為進(jìn)一步考察優(yōu)化工藝的可靠性，按上述最佳提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，制成3份包合物，測定其丹皮酚包合率，方法同上。包合率依次為88.36%、88.61%、88.90%。檢驗(yàn)結(jié)果與上述最佳工藝無顯著差異，平均包合率為88.62%，高于正交表上的包合率，故最佳工藝為A3B1C3D1即β-環(huán)糊精∶丹皮酚(0.4 g)∶揮發(fā)油(0.5 mL)=8∶0.4∶0.5，加入 3 倍β-環(huán)糊精量的水研磨，研磨2 h，用5 mL(0.5 mL揮發(fā)油，0.4 g丹皮酚時)無水乙醇沖洗。

2.7 β-環(huán)糊精包合揮發(fā)油和丹皮酚穩(wěn)定性試驗(yàn)

制作三批β-環(huán)糊精包合揮發(fā)油和丹皮酚包合物(于室溫下留樣觀察)，以丹皮酚包合率為考察指標(biāo)，當(dāng)月考察一次，以后每月考察一次，連續(xù)考察三個月后，于六個月再分別進(jìn)行考察，每次每份取約0.1 g，定容至50 mL 容量瓶中，按“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件，各進(jìn)樣10 μL，測得三批包合物平均包合率分別為 87.20%、88.14%、88.32%，RSD 值分別為0.55%、0.17%、0.38%，結(jié)果表明包合物在 6 個月內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 β-環(huán)糊精包合揮發(fā)油和丹皮酚均一性試驗(yàn)

取第三批β-環(huán)糊精包合揮發(fā)油和丹皮酚包合物，從中隨機(jī)抽取十份，每份取約0.1 g，定容至50 mL容量瓶中，按“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件，各進(jìn)樣10 μL，測得丹皮酚的平均飽和率為 87.91%(n=10)，RSD為1.27%，表明該包合物均一性良好。

2.9 包合物含水量測定

按《中國藥典》(2010年版一部)附錄IX H水分測定法第二法測定，精密稱定供試品包合物14.9121 g，置于500 mL短頸圓底燒瓶中，加甲苯約200 mL，加入干燥、潔凈的沸石，將儀器各部分連接，將圓底燒瓶緩緩加熱，待甲苯開始沸騰時，調(diào)節(jié)溫度，使每秒鐘餾出2滴。待水分完全餾出后，即測定管刻度部分的水量不再增加時，將冷凝管內(nèi)部先用甲苯?jīng)_洗，再用飽蘸甲苯的長刷將管壁上附著的甲苯推下，繼續(xù)蒸餾5 min，放冷至室溫，拆卸裝置，放置，使水和甲苯完全分離。檢讀水量，并計算供試品中的含水量(%)。公式如下:

經(jīng)計算，該包合物含水量=1.3 mL×1 g/mc3/14.9121 g×100%=8.72%，符合國家藥典規(guī)定。

3 討論

石菖蒲中主要成分為揮發(fā)油，牡丹皮中主要成分為丹皮酚，兩者在中國藥典2010年版一部收載的該藥材標(biāo)準(zhǔn)中都是含量測定部分，揮發(fā)油有鎮(zhèn)靜，促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶和抗癡呆作用;丹皮酚具有免疫調(diào)節(jié)功能，對治療老年癡呆有重要作用，因此，揮發(fā)油和丹皮酚的包合工藝研究具有實(shí)際應(yīng)用意義。

丹皮酚在高溫是易揮發(fā)，在熱水中溶解的特性;石菖蒲揮發(fā)油為止痛的有效成分，性質(zhì)不穩(wěn)定，從而降低療效。根據(jù)處方中牡丹皮的含量和用量，處方中共含有丹皮酚0.4 g，我們將丹皮酚和石菖蒲揮發(fā)油同時包合在β-環(huán)糊精中，從而提高丹皮酚和揮發(fā)油的利用率，增強(qiáng)藥效。

通過正交設(shè)計對石菖蒲揮發(fā)油和丹皮酚的包合工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并按最佳工藝進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析表明，β-環(huán)糊精∶丹皮酚(0.4 g)∶揮發(fā)油(0.5 mL)的比值和用無水乙醇沖洗量對包合的結(jié)果有顯著性影響，加水量、研磨時間對包合沒有太大的影響。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果與正交表中的最優(yōu)水平一致，說明實(shí)驗(yàn)確定的工藝合理。

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