鏈霉菌3704殺蟲成分及對(duì)小菜蛾的毒力測(cè)定

沈會(huì)芳，張廣文，林壁潤(rùn)*，蒲小明

1廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所廣東省植保新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640;2暨南大學(xué)藥學(xué)院，廣州 510632

殺蟲抗生素是一類由微生物產(chǎn)生的具有殺蟲活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有高效、?；蛯?duì)環(huán)境安全等特點(diǎn)。從20世紀(jì)50年代，開始對(duì)殺蟲抗生素進(jìn)行研究，其中阿維菌素是開發(fā)最成功的品種［1］，自投放市場(chǎng)以來(lái)，成為繼Bt制劑、井岡霉素之后的生物農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)又一支柱產(chǎn)品。我國(guó)農(nóng)用抗生素研究起步于20世紀(jì)80年代，相繼研發(fā)出一批新品種，如浙江農(nóng)科院的殺蚜素、上海農(nóng)藥研究所的瀏陽(yáng)霉素、上海農(nóng)科院植保所的韶關(guān)霉素［2］、江西農(nóng)業(yè)大學(xué)的南昌霉素和梅嶺霉素等［3］。但害蟲具有多樣性，且對(duì)現(xiàn)有的農(nóng)藥品種不斷產(chǎn)生抗藥性，這要求不斷開發(fā)新農(nóng)用抗生素以滿足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)需要。

本課題組在東南亞及中國(guó)內(nèi)地采集土壤樣品，分離鏈霉菌近3000株，以蔬菜重要害蟲小菜蛾(Plutella xylostella)為靶標(biāo)篩選殺蟲抗生素，獲得殺蟲素3704，該活性物質(zhì)對(duì)小菜蛾、蚜蟲和水產(chǎn)害蟲錨頭蚤有較好的殺蟲效果。本文報(bào)道了殺蟲素3704對(duì)小菜蛾的生物活性，并對(duì)該活性物質(zhì)進(jìn)行分離鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

鏈霉菌3704(Streptomyces sp.)分離自烏魯木齊伊寧那抗提的沿河樹林，在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號(hào)為CCTCC No:M206067。

小菜蛾(P.xylostella)于室內(nèi)人工飼料繼代培養(yǎng)。

培養(yǎng)基:生長(zhǎng)培養(yǎng)基:高氏一號(hào)瓊脂;發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖2%、可溶性淀粉1%、豆餅粉1.5%、玉米漿 1.5%、NaCl 0.5%、CaCO30.3%、pH 7.0 ～7.2。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 殺蟲素3704粗提物的制備

將鏈霉菌3704斜面成熟孢子制成孢子懸浮液，接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，接種量為10%，發(fā)酵溫度30℃，轉(zhuǎn)速150 rpm，發(fā)酵培養(yǎng)96 h后，離心，保留菌絲體，用60%的丙酮浸泡12 h，離心后，保留浸泡液。用大孔樹脂對(duì)浸泡液進(jìn)行吸附后，丙酮洗脫，然后減壓濃縮，得到棕色油狀物，為殺蟲素3704的粗提物。

1.2.2 殺蟲素3704粗提物對(duì)小菜蛾2齡幼蟲的殺蟲活性

將殺蟲素3704粗提物用丙酮配制不同濃度的溶液，把菜心葉片浸泡于溶液中30 min，取出，自然晾干，將30頭2齡小菜蛾幼蟲接到處理后的菜心葉片上，每處理3個(gè)重復(fù)，在28℃條件下養(yǎng)殖，每24 h調(diào)查死亡蟲數(shù)，計(jì)算藥劑LC50及其回歸方程。殺蟲素粗提物溶液濃度分別為 1.75、3、17.5、30、175 和350 μg/mL，對(duì)照用純丙酮溶液處理。

1.2.3 殺蟲素3704粗提物對(duì)小菜蛾2齡幼蟲的盆栽防治試驗(yàn)

挖取大小較一致約有5片葉的菜心植株，移栽于花盆中，每盆3棵。移栽7d后，每盆接50頭以上大小較一致的2齡小菜蛾幼蟲，24 h后，檢查植株上蟲量，若有逃逸則補(bǔ)足50頭，用手持噴霧器對(duì)葉片正反面及莖均勻噴施藥液。殺蟲素3704粗提物濃度分別為500、250和125 μg/mL，阿維菌素濃度為8 μg/mL，每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，另設(shè)置清水對(duì)照。施藥后48、72、96 h調(diào)查植株上的活蟲量，計(jì)算蟲口減退率和防治效果。

1.2.4 殺蟲素3704活性組分的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定

將3704粗提物加水混合均勻后，分別用乙酸乙酯、正丁醇分配萃取各三次，利用其殺蟲活性跟蹤有效物質(zhì)，經(jīng)真空液相層析(VLC)，以石油醚/乙酸乙酯溶劑體系梯度洗脫，共得到9個(gè)組分。經(jīng)活性檢測(cè)，其中主要組分3704-1具有殺蟲活性，將其進(jìn)一步進(jìn)行純化，獲得純品，進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 殺蟲素3704粗提物對(duì)小菜蛾2齡幼蟲的殺蟲活性

從表1可見，殺蟲素3704粗提物對(duì)小菜蛾2齡幼蟲的殺蟲活性為 24 h時(shí) LC50為 59.82842 μg/mL，48 h 為 38.66165 μg/mL，72 h 為 22.69325 μg/mL。可見隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)小菜蛾2齡幼蟲的殺蟲活性的LC50越來(lái)越小，72 h的LC50比24 h的LC50降低近2.2倍，表明隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，殺蟲素3704對(duì)小菜蛾2齡幼蟲的殺蟲活性越高。

表1 3704粗提物對(duì)小菜蛾2齡幼蟲的生物活性Table 1 Insecticidal activities of the crude extract of 3704 against the 2ndinstar larvae of P.xylostella

2.2 殺蟲素3704粗提物對(duì)小菜蛾2齡幼蟲的盆栽防治試驗(yàn)

從表2可知，施藥后48 h，3704粗提物的500 μg/mL劑量對(duì)小菜蛾2齡幼蟲的防治效果與阿維菌素的8 μg/mL劑量的同期防效相當(dāng)，當(dāng)施藥時(shí)間延長(zhǎng)到72和96 h后，500 μg/mL的3704粗提物的防治效果則稍低于8 μg/mL的阿維菌素的同期防效。

表2 3704粗提物對(duì)小菜蛾2齡幼蟲的盆栽防治效果(%)Table 2 The control efficacy of the crude extract of 3704 against the 2ndinstar larvae of P.xylostella in pots

2.3 殺蟲活性成分結(jié)構(gòu)鑒定

殺蟲活性成分3704-1為無(wú)色片狀結(jié)晶，活性成分m.p.111～113 ℃。由 ESI-MS m/z 387［M+Na］+得知分子量為364，結(jié)合13C NMR譜顯示有28個(gè)碳、DEPT譜顯示有6個(gè)甲基，1個(gè)亞甲基和5個(gè)次甲基，元素分析表明化合物3704-1中含有硫、氮和氯，并根據(jù)偶氮規(guī)則，分子中應(yīng)含有兩個(gè)N原子，可確定化合物3704-1分子式C19H25ClN2OS，不飽和度為 8。經(jīng)1H NMR譜、13C NMR譜、1H-1H COSY譜、HMBC譜、DEPT譜和HSQC譜等綜合分析，與已有化合物進(jìn)行比對(duì)，鏈霉菌3704產(chǎn)生的殺蟲活性成分為已知物Pyridaben，中文名噠螨酮，系統(tǒng)名為2-叔丁基-5-(4-叔丁基芐硫基)-4-氯-3(2H)-噠嗪酮(圖1)。

圖1 化合物3704-1的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of compound 3704-1

Pyridaben是日本日產(chǎn)化學(xué)工業(yè)公司1984年發(fā)現(xiàn)的噠嗪酮類化合物，1991年商品化，對(duì)植食性害螨整個(gè)生長(zhǎng)期和粉虱、蚜蟲、薊馬等均有效。對(duì)益蟲安全，對(duì)哺乳動(dòng)物毒性低，LD50(鼠)820～135 mg/kg，在環(huán)境中的持效期短，DT50為20 d。目前，該品種在我國(guó)已有較多企業(yè)生產(chǎn)并廣泛應(yīng)用，是我國(guó)殺螨劑的主要品種之一。

3 結(jié)論

本研究以小菜蛾為靶標(biāo)篩選出鏈霉菌3704，3704粗提物對(duì)農(nóng)業(yè)重要害蟲小菜蛾有較好的殺蟲活性，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)小菜蛾2齡幼蟲殺蟲活性的LC50越來(lái)越小，表明其殺蟲活性越高。盆栽防治試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，施藥48 h，3704粗提物500 μg/mL劑量對(duì)小菜蛾2齡幼蟲的防治效果與8 μg/mL劑量的阿維菌素相當(dāng)，但隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)到72和96 h，其防治則稍低于阿維菌素。

3704殺蟲活性物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)經(jīng)鑒定為已有并商品化的殺螨劑Pyridaben，Pyridaben自發(fā)現(xiàn)以來(lái)一直以化學(xué)方法進(jìn)行合成生產(chǎn)，本研究首次從微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物中分離出該活性物質(zhì)。Pyridaben屬噠嗪酮類化合物，該類化合物通過(guò)在輔酶Q位點(diǎn)上與復(fù)合物I鍵合來(lái)抑制線粒體的電子傳遞鏈，從而高效阻止線粒體的分離的復(fù)合物I氧化作用，達(dá)到殺死蟲體的效果［4］。本研究發(fā)現(xiàn)Pyridaben對(duì)小菜蛾也有較好的殺蟲效果。

1 Mrozik H，Eskola P，Linn BO.Discovery of novel avermectins with unprecedented insecticidal activity.Experientia，1989，45:315-316.

2 Liu X(劉旭)，Liu HL(劉虹伶)，Xia XQ(夏先全).A progress and development foresight of antibiotic insecticides.Southwest China J Agric Sci(西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào))，2007，20:1283-1286.

3 Sun YH(孫宇輝)，Zhou XF(周秀芬)，Tu GQ(涂國(guó)全)，et al.Overview and prospect on the study of secondary metabolites and metabolic engineering of Streptomyces nanchangensis.Chin Bull Life Sci(生命科學(xué))，2005，17:207-210.

4 Yuan JZ(袁建忠)，Tang ZH(唐振華).Acaricide and its reacting mechanism.World Pest(世界農(nóng)藥)，2005，27(6):1-5.