土鱉蟲(chóng)不同部位水提液對(duì)MC3T3-E1、HUVEC細(xì)胞活力及對(duì)H2O2損傷保護(hù)的影響

王慧慧，位雪，謝雪晴，鄧玉瑩，王晶，王春梅（北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100029）

土鱉蟲(chóng)又稱土元、地鱉蟲(chóng)等，為鱉蠊科昆蟲(chóng)地鱉（Eupolyphaga sinensisWalker）或冀地鱉 [Steleophaga plancyi（Boleny）]的雌蟲(chóng)干燥體[1]。中藥土鱉蟲(chóng)藥性咸寒、歸肝經(jīng)，有小毒，有破血逐瘀、續(xù)筋接骨之功效，用于跌打損傷、筋傷骨折、癥瘕痞塊、血瘀經(jīng)閉、產(chǎn)后瘀阻腹痛等[2]。其促進(jìn)骨折愈合的功效明確而效果顯著，臨床應(yīng)用較廣。2015年版《中國(guó)藥典》中含有土鱉蟲(chóng)的處方共 29 份，其中 14 份用于治療跌打損傷，可見(jiàn)土鱉蟲(chóng)的促骨折愈合活性值得重視。

中藥藥效不僅受藥材品種、產(chǎn)地、采收期、炮制等因素的影響，入藥部位的選擇也非常重要。體型較大的動(dòng)物藥多以部位入藥（如鹿茸、鱉甲，水牛角等），如鹿茸還根據(jù)不同部位又進(jìn)一步分為蠟片、粉片、血片、骨片，不同部位藥材功效不同[3-5]。對(duì)于體型較小的昆蟲(chóng)類因采集的復(fù)雜性多以全體入藥，但隨著技術(shù)的進(jìn)步，分部位入藥已經(jīng)不難實(shí)現(xiàn)。對(duì)于昆蟲(chóng)不同部位活性的差異也已有相關(guān)研究。如全蝎中，古人認(rèn)為蝎子之毒乃至藥力主要集中在尾，近代根據(jù)這一特點(diǎn)采用一次性剪尾提取，人工刺激、電刺激提取等提取工藝也逐漸成熟[6]，獲得了臨床療效的更好產(chǎn)品。因此，深入研究蟲(chóng)類藥的用藥部位對(duì)于精準(zhǔn)用藥及中藥精制有重要價(jià)值。

研究證明土鱉蟲(chóng)在體內(nèi)外均具有促進(jìn)骨折愈合的作用，并發(fā)現(xiàn)體外細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)和大鼠體內(nèi)促骨折愈合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果具有很好的一致性[7-9]。但關(guān)于土鱉蟲(chóng)的活性物質(zhì)主要集中于什么部位未見(jiàn)報(bào)道，限制了對(duì)其深入開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。因此本研究以前期實(shí)驗(yàn)室建立的成骨細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞模型對(duì)全體、背殼、腹殼、肉體的活性進(jìn)行分析，為土鱉蟲(chóng)的深入開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材

鮮品土鱉蟲(chóng)購(gòu)自安徽亳州藥材市場(chǎng)，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定系楊瑤君教授鑒定為鱉蠊科昆蟲(chóng)地鱉Eupolyphaga sinensis雌蟲(chóng)。

1.2 細(xì)胞

小鼠胚胎成骨前體細(xì)胞（MC3T3-E1），由中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所生化實(shí)驗(yàn)室張貴峰教授饋贈(zèng)，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的MEM 培養(yǎng)基中；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）（存于北京中醫(yī)藥大學(xué)生物制藥系）培養(yǎng)于含有 15%胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基中。

1.3 儀器與試藥

噻唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）（美國(guó) Sigma 公司）；HyClone 胎牛血清、DMEM 和MEM 培養(yǎng)基（賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司）；胰酶（美國(guó)Amresco 公司）；過(guò)氧化氫溶液（廣東恒健制藥有限公司）；冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；Bio TEK Epoch 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Biotek 公司）；TE2000-U 倒置顯微鏡（Nikon 公司）；無(wú)水乙醇、氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀（北京化工廠）。

2 方法

2.1 土鱉蟲(chóng)各部位水提物的制備

將活體土鱉蟲(chóng)于－80℃冰箱處死即得鮮土鱉蟲(chóng)，取一部分用作全土鱉蟲(chóng)，其余用水洗凈，棄掉頭足，分成背殼、腹殼、肉體三部分。分別取背殼、腹殼、肉體及全土鱉蟲(chóng)適量，剪碎并研磨，按料液比1∶20（W/V，g/mL，下同）加入蒸餾水，浸泡1 h，煎煮40 min，過(guò)濾收集第一次濾液，濾渣1∶15 加入蒸餾水繼續(xù)煎煮 40 min，過(guò)濾收集第二次濾液，合并兩次濾液，4℃、8000 r·min－1離心20 min，上清液過(guò)0.45 μm 的濾膜后用真空冷凍干燥機(jī)凍干，分別稱重。并根據(jù)公式計(jì)算產(chǎn)物得率（%）＝土鱉蟲(chóng)各部位凍干粉干重/土鱉蟲(chóng)各部位用量×100%。

2.2 土鱉蟲(chóng)各部位對(duì)MC3T3-E1、HUVEC 細(xì)胞增殖的影響

按照文獻(xiàn)方法[10]，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞（單位體積細(xì)胞個(gè)數(shù)為2×104個(gè)·mL－1，每孔100 μL）接種到96 孔板中，孵育24 h 后，將實(shí)驗(yàn)設(shè)置為正常對(duì)照組（control），土鱉蟲(chóng)背殼、腹殼、肉體和全體不同濃度加藥組，對(duì)應(yīng)加入150 μL培養(yǎng)基和各濃度稀釋樣品，每組重復(fù)6 次。置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育24 h。用倒置顯微鏡觀察并拍照監(jiān)測(cè)形態(tài)變化。每孔加入100 μL 含0.5 mg·mL－1MTT 的PBS 再孵育4 h，除去上清液，加入150 μL DMSO 并搖動(dòng)10 min。使用酶標(biāo)儀測(cè)量570 nm 處吸光度。細(xì)胞增殖率（%）＝（加藥組A570－對(duì)照組A570）/ 對(duì)照組A570×100%。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

2.3 土鱉蟲(chóng)各部位對(duì)H2O2 損傷MC3T3-E1、HUVEC 細(xì)胞的保護(hù)作用[7]

采用先損傷再保護(hù)的方法。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞（單位體積細(xì)胞個(gè)數(shù)為4×104個(gè)·mL－1，每孔100 μL）接種到96 孔板中，孵育24 h 后分組。正常對(duì)照組：完全培養(yǎng)基培養(yǎng)（MEM 或DMEM培養(yǎng)基）；損傷模型組：含300 μmol·L－1H2O2的基礎(chǔ)培養(yǎng)基處理細(xì)胞（MC3T3-E1 損傷8 h、HUVEC 損傷7 h）；土鱉蟲(chóng)背殼、腹殼、肉體及全體水提液加藥組：先構(gòu)建損傷模型，然后加入不同濃度的藥液進(jìn)行干預(yù)，每組重復(fù)6 次。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育24 h，MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活力。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graphpad Prism 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 土鱉蟲(chóng)不同部位占比及水提物得率

土鱉蟲(chóng)背殼、腹殼、肉體各部位在全體中所占的比重及各部位水提物得率見(jiàn)表1，背殼、腹殼、肉體的物質(zhì)得率差異不大，全體土鱉蟲(chóng)可能因?yàn)轭^和腿的可溶性物質(zhì)溶出少，得率略低。

表1 土鱉蟲(chóng)不同部位占比及物質(zhì)得率Tab 1 Proportion and material yield of different parts of ESWE

3.2 土鱉蟲(chóng)各部位對(duì)MC3T3-E1、HUVEC 細(xì)胞活力的影響

3.2.1 土鱉蟲(chóng)各部位對(duì)MC3T3-E1 細(xì)胞活力的影響 土鱉蟲(chóng)各部位不同濃度水提物均能增強(qiáng) MC3T3-E1 細(xì)胞的活力（見(jiàn)圖1），細(xì)胞活力隨劑量的提高而增強(qiáng)（P＜0.01）。其中，對(duì)MC3T3-E1 細(xì)胞的作用土鱉蟲(chóng)全體、背殼、腹殼各質(zhì)量濃度組均高于土鱉蟲(chóng)肉體組。高濃度（1.5、2 mg·mL－1）時(shí)土鱉蟲(chóng)全體組的細(xì)胞活力最高，當(dāng)質(zhì)量濃度≤1 mg·mL－1時(shí)各部位增強(qiáng)細(xì)胞活力的效果為：背殼＞全體＞腹殼＞肉體。

圖1 土鱉蟲(chóng)各部位水提物對(duì) MC3T3-E1 及HUVEC 細(xì)胞活力的影響（±s，n＝6）Fig 1 Effect of different parts of ESWE on the viability of MC3T3-E1 and HUVEC cells（±s，n＝6）

3.2.2 土鱉蟲(chóng)各部位對(duì)HUVEC 細(xì)胞活力的影響 土鱉蟲(chóng)各部位不同濃度水提物均能增強(qiáng)HUVEC 的細(xì)胞活力（見(jiàn)圖2），細(xì)胞活力隨劑量的提高而增強(qiáng)（P＜0.05）。其中，對(duì)HUVEC 細(xì)胞的作用土鱉蟲(chóng)全體、背殼、腹殼組高于土鱉蟲(chóng)肉體組（P＜0.05）。高濃度（1、2 mg·mL－1）時(shí)土鱉蟲(chóng)全體組的增強(qiáng)細(xì)胞活力的效果最好，背殼的效果次之，但兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；低濃度時(shí)的促增殖效果為：背殼＞全體＞腹殼＞肉體，同MC3T3-E1 細(xì)胞的結(jié)果一致。

3.3 土鱉蟲(chóng)各部位對(duì)H2O2 損傷MC3T3-E1、HUVEC 細(xì)胞的保護(hù)作用

3.3.1 土鱉蟲(chóng)各部位對(duì)H2O2損傷MC3T3-E1 細(xì)胞的保護(hù)作用 設(shè)正常對(duì)照組細(xì)胞活力為100%，經(jīng)H2O2損傷后MC3T3-E1 細(xì)胞的活力降為26.51%，表示造模成功。造模成功后加藥保護(hù)，當(dāng)土鱉蟲(chóng)各部位水提物質(zhì)量濃度為 0.05 mg·mL－1時(shí)，細(xì)胞活力有所升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。隨著用藥質(zhì)量濃度的升高，對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用也越來(lái)越明顯；當(dāng)土鱉蟲(chóng)全體、背殼、腹殼、肉體的用藥質(zhì)量濃度為2 mg·mL－1時(shí)，MC3T3-E1 細(xì)胞的活力分別恢復(fù)至201.61%、204.36%、201.43%、192.92%（P均＜0.01）。同一質(zhì)量濃度比較時(shí)，肉體組的損傷保護(hù)作用較其他樣品處理組弱（見(jiàn)圖2）。

3.3.2 土鱉蟲(chóng)各部位對(duì)H2O2損傷HUVEC 細(xì)胞的保護(hù)作用 設(shè)正常對(duì)照組細(xì)胞活力為100%，經(jīng)H2O2損傷后HUVEC 細(xì)胞的活力降為正常對(duì)照組的25.03%，表示造模成功。造模成功后加藥保護(hù)，當(dāng)土鱉蟲(chóng)各部位水提物用藥質(zhì)量濃度為 0.05 mg·mL－1時(shí)，細(xì)胞活力有所升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。隨著用藥質(zhì)量濃度的升高，對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用也越來(lái)越明顯，當(dāng)質(zhì)量濃度大于0.5 mg·mL－1時(shí)，背殼的保護(hù)作用最好，肉體的保護(hù)作用最弱（見(jiàn)圖2）。

圖2 用藥24 h 后土鱉蟲(chóng)各部位水提物對(duì)H2O2 損傷的MC3T3-E1及HUVEC 細(xì)胞的保護(hù)作用（±s，n＝6）Fig 2 Effect of different parts of ESWE treated for 24 h on H2O2 damage protection of MC3T3-E1 and HUVEC cells

4 討論

土鱉蟲(chóng)在臨床上具有確切的促進(jìn)骨折愈合的作用[11-12]，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，土鱉蟲(chóng)體外可以誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，體內(nèi)可以促進(jìn)兔下頜骨牽張成骨過(guò)程中的骨形成，其作用機(jī)制均可能是促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)有關(guān)[13-14]。本文選擇常用的成骨細(xì)胞MC3T3-E1 和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC 對(duì)土鱉蟲(chóng)不同部位活性進(jìn)行研究，以期找到有效成分密集的部位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)土鱉蟲(chóng)全體、背殼、腹殼、肉體對(duì)體外培養(yǎng)的MC3T3-E1、HUVEC 細(xì)胞均有促進(jìn)細(xì)胞增殖活力作用，背殼的效果最好。

氧化應(yīng)激能夠抑制成骨細(xì)胞前體細(xì)胞系向成骨細(xì)胞的分化，誘導(dǎo)其死亡[15-16]。本文用H2O2氧化損傷細(xì)胞模擬骨折過(guò)程中損傷的細(xì)胞，構(gòu)建了MC3T3-E1、HUVEC 細(xì)胞H2O2氧化應(yīng)激損傷模型來(lái)研究土鱉蟲(chóng)不同部位對(duì)細(xì)胞氧化損傷的修復(fù)作用，發(fā)現(xiàn)土鱉蟲(chóng)各部位均能使損傷的MC3T3-E1 細(xì)胞的增殖活力明顯升高；背殼組對(duì)氧化損傷的HUVEC 細(xì)胞的保護(hù)作用最好。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明土鱉蟲(chóng)中增強(qiáng)細(xì)胞活力和保護(hù)細(xì)胞氧化損傷的活性物質(zhì)可能更多的集中于甲殼部分，這為土鱉蟲(chóng)的深加工以及活性成分的深入研究提供參考。