結(jié)直腸癌組織中HNF4α的細(xì)胞內(nèi)定位及臨床意義

張 梁，元輝雄，黃永秩

(1.廣西右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西 百色 533000;2.廣西右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，廣西 百色 533000)

肝細(xì)胞核因子4α(hepatocyte nuclear factor-4alpha，HNF4α)屬于核受體超家族成員之一，是一種多功能的轉(zhuǎn)錄因子，在生長(zhǎng)發(fā)育、代謝和疾病中控制著許多基因的表達(dá)[1]。HNF4α在人體肝、腎、心、脾、腸等器官中均有表達(dá)[2]，至今已有許多關(guān)于其參與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程的報(bào)道，但HNF4α在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其作用的研究報(bào)道較少[3-6]，其研究結(jié)果也存在較大差異。為此，本研究采用免疫組化方法，對(duì)HNF4α在結(jié)直腸癌及癌旁正常組織中的細(xì)胞內(nèi)定位及表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，探討其與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

材料和方法

一、病例和材料

收集右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2008年3月至2011年3月行手術(shù)治療的結(jié)直腸癌患者132例，其中男83例，女49例，年齡43～71歲。高分化11例，中分化31例，低分化90例;臨床Dukes分期，A期19例，B期27例，C期56例，D期30例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移53例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移79例。所有病例術(shù)前未采用任何放化療或生物治療，標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)診斷證實(shí)。取癌組織和配對(duì)癌旁正常組織(經(jīng)病理學(xué)診斷證實(shí)[7]的正常組織，距腫瘤邊緣約5 cm)各132份。

二、試劑與檢測(cè)方法

HNF4α石蠟切片的免疫組化染色采用Santa Cruz公司Immuno CruzTMstaining system SP法免疫組化試劑盒產(chǎn)品，HNF4α抗體為羊來(lái)源的多克隆抗體，工作濃度為 1∶75，用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗進(jìn)行空白對(duì)照，HNF4α陰性對(duì)照加試劑盒附帶的正常羊血清。

三、免疫組化結(jié)果判定

以出現(xiàn)棕黃色顆粒染色為陽(yáng)性，計(jì)分標(biāo)準(zhǔn):Ⅰ類根據(jù)染色細(xì)胞總數(shù)，＜5%為0分，5% ～25%為1分，25% ～50%為2分，＞50%為3分 ;Ⅱ類根據(jù)著色強(qiáng)度，細(xì)胞染色呈陰性為0分，呈淡黃色為1分，呈棕黃色為2分，呈棕褐色為3分。Ⅰ類與Ⅱ類分?jǐn)?shù)相加的總分作為判斷結(jié)果，總分為0視為陰性(－)，1～2為弱陽(yáng)性(+)，3～4為中等陽(yáng)性(++)，5～6為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。每張切片隨機(jī)抽取5個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算平均得分作為最終結(jié)果[3]。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

結(jié) 果

一、HNF4α蛋白的表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)定位

免疫組化結(jié)果顯示，HNF4α蛋白分子的表達(dá)定位于細(xì)胞漿或細(xì)胞核，呈棕黃色。結(jié)直腸癌組織細(xì)胞漿中HNF4α表達(dá)陽(yáng)性率為76.5%，而癌旁正常組織細(xì)胞漿中 HNF4α表達(dá)陽(yáng)性率為3.8%;結(jié)直腸癌組織細(xì)胞核中HNF4α表達(dá)陽(yáng)性率為12.9%，而癌旁正常組織細(xì)胞核中HNF4α表達(dá)陽(yáng)性率為64.4%。與癌旁正常組織相比，結(jié)直腸癌組織細(xì)胞漿和細(xì)胞核中HNF4α的表達(dá)陽(yáng)性率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=145.3，χ2=73.9，P ＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 HNF4α在結(jié)直腸癌組織及相應(yīng)的癌旁正常組織中的細(xì)胞內(nèi)定位[例(%)]

二、HNF4α蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征間的關(guān)系

細(xì)胞漿中HNF4α蛋白表達(dá)陽(yáng)性率在不同腫瘤分化程度、Dukes分期間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.02、P=0.03);與患者性別、年齡(≥55 歲或＜55歲)、腫瘤位置、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征無(wú)明顯相關(guān)性(P均＞0.05)。見(jiàn)表2。

表2 細(xì)胞漿HNF4α表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

討 論

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，近年來(lái)發(fā)病率有逐年上升的趨勢(shì)[3]，但其發(fā)生、發(fā)展是多步驟、多環(huán)節(jié)、多因素、多分子參與的復(fù)雜過(guò)程。HNF4α是一種核轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)物質(zhì)代謝及細(xì)胞分化的許多基因都起著重要的調(diào)節(jié)作用，在惡性腫瘤中扮演重要角色，已有研究證明HNF4α具有抑制肝細(xì)胞癌的作用[4]。近年來(lái)HNF4α與結(jié)直腸腫瘤的關(guān)系日益受到重視，但HNF4α在結(jié)直腸腫瘤的表達(dá)及其意義一直存在爭(zhēng)議。

Schwartz等[8]通過(guò)配體拮抗劑抑制 HNF4α的轉(zhuǎn)錄與蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)被抑制，HNF4α具有促進(jìn)腫瘤形成的作用。Darsigny等[4]通過(guò) ApcMin小鼠的對(duì)比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，缺乏HNF4α?xí)r腸腫瘤被抑制，也說(shuō)明HNF4α能促進(jìn)腸腫瘤形成。而寧北芳[9]對(duì)大鼠的研究則表明，HNF4α具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)的作用。Chellappa等[5]通過(guò)研究HNF4α的啟動(dòng)子亞型發(fā)現(xiàn)，近80%結(jié)腸癌樣本的核HNF4α P1啟動(dòng)子亞型是缺失的，核HNF4α表達(dá)的缺失，可能是結(jié)腸癌的早期跡象，核HNF4α具有預(yù)防結(jié)腸癌的作用。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織細(xì)胞漿中HNF4α的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織，而細(xì)胞核中的表達(dá)顯著低于癌旁正常組織，結(jié)合Chellappa等[5]的研究結(jié)果分析，可能是由于結(jié)直腸癌組織中的Src酪氨酸激酶使細(xì)胞核內(nèi)的HNF4α磷酸化，在配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(ligand binding domain，LBD)的磷酸化模擬突變(phosphomimetic mutants)又使磷酸化的HNF4α蛋白的穩(wěn)定性、核表達(dá)和轉(zhuǎn)活功能下降;而HNF4α的表達(dá)與Fas配體的表達(dá)直接相關(guān)[10]，HNF4α 表達(dá)減少，F(xiàn)as配體的表達(dá)也相應(yīng)減少，使Fas配體的促癌細(xì)胞凋亡及阻止癌細(xì)胞遷移的作用減弱，結(jié)直腸組織細(xì)胞的惡變因此而未能受到抑制，導(dǎo)致結(jié)直腸癌的發(fā)生。而結(jié)直腸組織HNF4α的細(xì)胞內(nèi)定位異常的機(jī)制目前尚不明了，有待更深入的研究。

進(jìn)一步分析結(jié)直腸癌組織細(xì)胞漿中HNF4α的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織細(xì)胞漿中HNF4α表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤部位無(wú)明顯相關(guān)性，而與分化程度和Dukes分期密切相關(guān)，因而可為結(jié)直腸癌的診斷及預(yù)后提供客觀依據(jù)。可能由于樣本量偏少，本研究尚不足以證實(shí)HNF4α與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在聯(lián)系，因此HNF4α與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系尚需更深入的研究。

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