肺癌腦轉(zhuǎn)移患者Th17細胞和IL-17水平變化的研究

何改平 張彬 張寶文 喬梁杰 田仲蘭 翟國巖 辛憲偉 楊春 劉培剛 張勇 徐玲玲

肺癌是導(dǎo)致患者死亡數(shù)量第一的惡性腫瘤[1]。美國2012年的數(shù)據(jù)顯示，肺癌新發(fā)病例約為22.6萬，其中男性11.6萬，女性11.0萬；而16.0萬例患者死于肺癌，其中男性8.8萬，女性7.2萬。我國腫瘤登記資料顯示，肺癌已經(jīng)位列城市腫瘤發(fā)病率和死亡率的第一位[2]。腦部是肺癌遠處轉(zhuǎn)移最常見的部位之一，肺癌腦轉(zhuǎn)移的發(fā)生率為23%-65%，是腦轉(zhuǎn)移腫瘤中最常見的類型。隨著肺癌發(fā)病率的逐年上升，頭顱CT、磁共振和PET-CT等各種診療技術(shù)的提高，肺癌腦轉(zhuǎn)移的檢出率也隨之增加。肺癌腦轉(zhuǎn)移預(yù)后較差，其中位生存期為3.1個-12個月[3]。

Th17細胞是一種新發(fā)現(xiàn)的輔助性T細胞。Th0細胞在IL-23等的刺激下分化成為Th17細胞，其主要分泌IL-17等細胞因子，視黃醇相關(guān)孤兒受體γt（retinoid-related orphan receptor-gamma t, RORγt）是其重要的轉(zhuǎn)錄因子。目前研究[4]發(fā)現(xiàn)Th17細胞在感染免疫、自身免疫性疾病和腫瘤免疫中均居于重要意義。我們對22例伴有腦轉(zhuǎn)移的肺癌患者外周血Th17細胞、血漿和腦脊液IL-17水平進行了研究，現(xiàn)報道如下。

1 資料和方法

1.1 病例資料 收集我院2010年1月-2012年12月就診肺癌腦轉(zhuǎn)移患者22例，其中男13例，女9例，中位年齡59（范圍34-78）歲。所有病例均經(jīng)病理學(xué)或者組織學(xué)確診，其中小細胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）12例，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）10例（其中腺癌7例，鱗癌3例）。根據(jù)UICC分期，所以患者均為IV期。20名健康對照來自我院查體中心，其中男10名，女10名，中位年齡57（范圍40-75）歲。肺癌腦轉(zhuǎn)移組和健康對照組在年齡和性別方面無明顯差異。研究方案已經(jīng)天津市第四醫(yī)院倫理委員會批準，所有研究對象均已簽署知情同意書。

1.2 儀器 鼠抗人PE-IL23R、鼠抗人FITC-CD4、鼠抗人APC-CD3、鼠抗人PE-IgG1鼠抗人FITC-IgG1、鼠抗人APC-IgG1、溶血素均為美國BD PharMingen公司產(chǎn)品；IL-17酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒為美國R&D公司產(chǎn)品；流式細胞儀為美國BD公司的BD FACSCalibur；酶標(biāo)儀為美國BioTek公司Elx800光吸收酶標(biāo)儀。

1.3 流式細胞檢測 采集患者及正常對照空腹外周靜脈血2 mL，肝素抗凝。每流式管中分別加入全血100 μL。各管中分別加入APC-CD3、FITC-CD4、PE-IL23R及同型IgG1對照單克隆抗體20 μL，混勻，室溫避光孵育30 min。加入溶血素2 mL，室溫避光10 min溶解紅細胞。1,500 rpm，離心5 min。去上清。加入PBS 5 mL，1,500 rpm，離心5 min，去上清。重復(fù)2次。200 μL多聚甲醛固定20 min。

流式細胞儀檢測分析。應(yīng)用IgG1作為同型對照，去除背景熒光。在FACSCalibur流式細胞儀上使用CellQuest3.0軟件（Macintosh）獲取細胞并進行分析。因為外周血DC細胞前向角（FSC）與單核細胞相似，側(cè)向角（SSC）與淋巴細胞相似，所以應(yīng)用FSC和SSC進行設(shè)門，選定單個核細胞群（包括淋巴細胞和單核細胞)，去除粒細胞和細胞碎片。獲取20,000個細胞進行分析。

1.4 腦脊液和血漿的采集和保存 采集無腰穿禁忌癥的患者腦脊液2 mL，-20oC凍存?zhèn)溆谩２杉颊呒罢φ湛崭雇庵莒o脈血2 mL，肝素抗凝。1,500 rpm，離心5 min。取上清，-20oC凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 ELISA檢測 操作按照IL-17 ELISA試劑盒說明書。具體如下：加入標(biāo)準品/標(biāo)本稀釋液1.0 mL至凍干標(biāo)準品中，待徹底溶解后，靜置15 min，混勻。稀釋為以下濃度：2,000 pg/mL、1,000 pg/mL、500 pg/mL、250 pg/mL、125 pg/mL、62.5 pg/mL、31.25 pg/mL、0 pg/mL。稀釋濃縮生物素化抗體（1:100）和濃縮酶結(jié)合物（1:100）。標(biāo)本激活：將450 μL標(biāo)準品/標(biāo)本稀釋液加入10 μL血漿標(biāo)本。加20 μL HCl(1 mol/L)，蓋緊，上下混勻。4oC放置60 min。加入20 μL NaOH（1 mol/L），蓋緊，上下混勻。除空白孔外，分別將標(biāo)本或不同濃度品（100 μL/孔）加入相應(yīng)孔中；用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37oC孵育60 min。洗板4次。除空白孔外，加入生物素化抗體工作液（100 μL /孔）；用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37oC孵育60 min。洗板4次。除空白孔外，加入酶結(jié)合物工作液（100 μL/孔）；用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37oC孵育30 min。洗板4次。加入顯色劑（100 μL/孔），避光37oC顯色20 min。加入終止液（100 μL/孔），混勻。立即應(yīng)用酶標(biāo)儀測定OD450值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 統(tǒng)計分析采用SPSS 11.0軟件完成。計量資料用Mean±SD表示，組間比較應(yīng)用方差分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺癌腦轉(zhuǎn)移患者外周血Th17細胞比例高于正常對照 我們應(yīng)用流式細胞術(shù)對肺癌腦轉(zhuǎn)移患者（n=22）外周血Th17細胞（CD3+CD4+IL-23R+細胞）進行檢測，發(fā)現(xiàn)其數(shù)量較正常對照（n=20）明顯增多（分別為4.65%±0.72%和2.71%±0.54%，P=0.04）。腦轉(zhuǎn)移的NSCLC患者（n=10）外周血Th17細胞比例為4.97%±1.14%，而腦轉(zhuǎn)移的SCLC患者（n=12）為4.38%±0.95%，兩者沒有明顯差異（P=0.69）（圖1）。

2.2 肺癌腦轉(zhuǎn)移患者血清IL-17水平高于正常對照 我們應(yīng)用ELISA方法檢測22例肺癌腦轉(zhuǎn)移患者血清IL-17水平，并與正常對照（n=20）的血清中IL-17進行比較。結(jié)果顯示，伴有腦轉(zhuǎn)移的肺癌患者血清IL-17水平為（117.4±16.43）pg/mL，正常對照血清IL-17水平為（72.55±8.19）pg/mL，兩者間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.02）。腦轉(zhuǎn)移的NSCLC患者（n=10）血清IL-17為104.4%±19.83%，而腦轉(zhuǎn)移的SCLC患者（n=12）為128.3%±25.56%，兩者沒有明顯差異（P=0.48）（圖2）。

2.3 肺癌腦轉(zhuǎn)移患者腦脊液IL-17水平高于無腦轉(zhuǎn)移的肺癌患者 我們應(yīng)用ELISA方法檢測19例肺癌腦轉(zhuǎn)移患者腦脊液中IL-17水平，并與沒有腦轉(zhuǎn)移的肺癌患者（n=16）的腦脊液中IL-17進行比較。結(jié)果顯示，伴有腦轉(zhuǎn)移的肺癌患者腦脊液IL-17水平為（73.21±7.52）pg/mL，沒有腦轉(zhuǎn)移的肺癌患者腦脊液IL-17水平為（50.25±8.04）pg/mL，兩者間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.04）（圖3）。

3 討論

圖1 肺癌腦轉(zhuǎn)移患者和正常對照外周血Th17細胞檢測。A：肺癌腦轉(zhuǎn)移患者外周血Th17流式檢測圖；B：正常對照外周血Th17流式檢測圖；C：肺癌腦轉(zhuǎn)移患者外周血Th17細胞比例高于正常對照組；D：NSCLC和SCLC腦轉(zhuǎn)移患者外周血Th17細胞比例沒有明顯差異。Fig 1 Peripheral blood Th17 cells in patients with brain metastases from lung cancer and health controls. A: Th17 cell was detected with flow cytometry using CD3+CD4+IL-23R+ marker in patients with brain metastases from lung cancer; B: Th17 cell was detected with flow cytometry using CD3+CD4+IL-23R+ marker in health controls; C: The percentage of Th17 cells in patients with brain metastases from lung cancer was higher than that in health controls; D: The percentage of Th17 cells in patients with NSCLC and SCLC. BM-LC: brain metastases from lung cancer; Cont: health controls. SCLC: small cell lung cancer; NSCLC: non-small cell lung cancer.

圖2 肺癌腦轉(zhuǎn)移患者和正常對照血漿IL-17檢測。A：肺癌腦轉(zhuǎn)移患者血清IL-17濃度高于對照組；B：NSCLC和SCLC腦轉(zhuǎn)移患者血清IL-17濃度。Fig 2. Serum IL-17 concentration in patients with brain metastases from lung cancer and health controls. A: Serum IL-17 concentration in patients with brain metastases from lung cancer was higher than that in health controls; B: Serum IL-17 concentration in patients with NSCLC and SCLC. BM-LC: brain metastases from lung cancer; Cont:health controls.

圖3 肺癌腦轉(zhuǎn)移患者和無腦轉(zhuǎn)移的肺癌患者腦脊液IL-17濃度。BM-LC：肺癌腦轉(zhuǎn)移；NBM-LC：無腦轉(zhuǎn)移的肺癌患者。Fig 3 Cerebrospinal fluid IL-17 concentration in patients with brain metastases from lung cancer and lung cancer without brain metastases. BM-LC: brain metastases from lung cancer; NBM-LC: lung cancer without brain metastases.

Th17是一種新發(fā)現(xiàn)的能夠分泌IL-17的T細胞亞群，在自身免疫性疾病和機體防御反應(yīng)中具有重要的意義。β轉(zhuǎn)化生長因子（transtroming growth factor β, TGF-β）、IL-6、IL-23、IL-21和IL-1在Th17細胞的分化形成過程中起著積極的促進作用，而γ干擾素（interferon gamma, IFN-γ）、IL-4、細胞因子信號傳送阻抑蛋白3（Socs3）和IL-2則抑制它的分化。Th17是由TH0細胞在IL-6和IL-23的刺激下分化而成的輔助性T細胞，主要分泌IL-17、IL-22等促炎癥因子，RORγt是其最重要的轉(zhuǎn)錄因子，其他重要的轉(zhuǎn)錄因子還包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（Stat3）、核受體ROR-α、IFN調(diào)節(jié)因子4（IRF-4）、B細胞激活轉(zhuǎn)錄因子（B-ATF）和低氧誘導(dǎo)因子1α（HIF1-α）[4]。

Th17細胞在腫瘤發(fā)病和進展中的作用目前還不清楚。目前研究發(fā)現(xiàn)，很多腫瘤患者存在Th17細胞浸潤，包括淋巴瘤、骨髓瘤、乳腺癌、大腸癌、胃癌、肝細胞肝癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌等。腫瘤浸潤的Th17細胞除了分泌細胞因子IL-17外，還分泌大量IL-8、TNF-α、IL-6、IL-10和TGF-β1，通過這些細胞因子，在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮作用。雖然現(xiàn)在研究已經(jīng)明確腫瘤微環(huán)境中存在大量Th17細胞，但是對于它們在腫瘤中的作用還有爭議[5]。

多數(shù)研究顯示Th17細胞促進腫瘤生長。腫瘤小鼠模型和腫瘤患者的臨床研究均發(fā)現(xiàn)IL-17和Th17細胞具有促進腫瘤生長的特性。IL-17和Th17細胞促進腫瘤生長的機制包括參與新生血管的形成和分泌細胞因子改變腫瘤微環(huán)境。在裸鼠內(nèi)，IL-17通過升高IL-6和IL-8水平，招募巨噬細胞到腫瘤部位，促進人類宮頸癌的生長[6]。結(jié)腸腺癌小鼠模型的研究顯示，IL-17誘導(dǎo)腫瘤新生血管形成，誘導(dǎo)腫瘤細胞和纖維母細胞分泌VEGF、PGE2、角質(zhì)細胞來源趨化因子和一氧化氮等血管形成因子[7]。非小細胞肺癌研究顯示，IL-17通過CXCR2依賴的新生血管形成方式，誘導(dǎo)血管形成。人類肝細胞肝癌研究顯示，腫瘤浸潤的IL-17細胞促進新生血管形成，促進腫瘤生長。IL-17誘導(dǎo)IL-6產(chǎn)生，IL-6激活腫瘤信號Stat3，上調(diào)腫瘤生存和血管形成基因[8]。

最近幾項臨床試驗也證實了IL-17和Th17在不同腫瘤中具有促進腫瘤生長的作用。Hahn等[9]報道Th17細胞隨著胃十二指腸部位癌前病變的進展而數(shù)量增加。Tosolini等[10]分析了125例大腸癌患者的冰凍腫瘤標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)Th17高表達的患者預(yù)后差，而Th1高表達的患者預(yù)后好。Wu等[11]研究發(fā)現(xiàn)，急性髓系白血病患者外周血Th17細胞數(shù)量較正常對照明顯升高，IL-17的水平也明顯升高。多發(fā)性骨髓瘤患者Th17細胞和IL-17水平升高，并抑制效應(yīng)免疫功能[12]。卵巢癌患者IL-17水平升高，招募TNF-α，促進腫瘤生長[13]。

雖然大多數(shù)研究顯示Th17細胞促進腫瘤生長，但也有研究顯示Th17細胞具有抑制腫瘤生長效應(yīng)。腫瘤小鼠模型顯示Th17細胞能直接根除腫瘤細胞。Muranski等[14]研究顯示腫瘤特異性Th17細胞能使小鼠模型中的黑色素瘤消退，這種治療作用依賴于產(chǎn)生的IFN-γ。主動轉(zhuǎn)染分泌IL-17的CD8 T細胞能增強抗腫瘤免疫，使巨大的B16黑色素瘤消退。轉(zhuǎn)染分泌IL-17的CD8 T細胞能轉(zhuǎn)化成產(chǎn)生IFNγ的效應(yīng)T細胞，發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。除了直接根除腫瘤細胞效應(yīng)外，Th17細胞還具有其他間接抗腫瘤效應(yīng)，如招募其他腫瘤特異性免疫細胞或者增強它們的抗腫瘤效應(yīng)。Benchetrit等[15]研究顯示，轉(zhuǎn)染IL-17到裸鼠中，IL-17不能抑制造血腫瘤的生長；而轉(zhuǎn)染到具有免疫功能的小鼠中，IL-17能抑制造血腫瘤的生長，這種抗腫瘤效應(yīng)是通過增加腫瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞實現(xiàn)的。Th17細胞通過促進腫瘤特異性CD8 T細胞激活方式，發(fā)揮間接抗腫瘤效應(yīng)。應(yīng)用腫瘤特異性Th17細胞進行主動T細胞治療，能招募樹突細胞進入腫瘤部位和附近的淋巴結(jié)，啟動強大的抗腫瘤CD8 T細胞反應(yīng)。IL-17缺陷小鼠腫瘤及其附近淋巴結(jié)中IFN-γ NK細胞和腫瘤特異性IFN-γ T細胞數(shù)量減少，導(dǎo)致腫瘤生長加速，并導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移。IL-17對于腫瘤的影響取決于已經(jīng)存在的主動免疫系統(tǒng)。存在淋巴細胞的情況下，IL-17抑制腫瘤生長；沒有淋巴細胞時，IL-17促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。絕大部分支持Th17細胞具有抗腫瘤效應(yīng)的證據(jù)都來自于小鼠模型，所以，Th17細胞是否在人體內(nèi)有抗腫瘤作用還不清楚。

我們研究結(jié)果顯示，肺癌腦轉(zhuǎn)移患者外周血Th17細胞數(shù)量和血漿IL-17的水平均高于正常對照，說明Th17細胞和IL-17在肺癌中屬于預(yù)后不良指標(biāo)，此類患者發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的幾率較大。Th17細胞數(shù)量和IL-17的水平與肺癌的病理類型沒有明顯的相關(guān)性，不具有腫瘤類型的特異性。腦轉(zhuǎn)移肺癌患者的腦脊液中IL-17表達水平高于沒有腦轉(zhuǎn)移的肺癌患者，提示Th17細胞和IL-17參與了肺癌發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的機制。

與其他腫瘤研究一樣，Th17細胞和IL-17在肺癌中的作用是促進腫瘤生長還是抑制腫瘤生長還沒有定論。早期的研究[16]顯示腫瘤來源的Th17細胞和IL-17是肺癌以后良好的標(biāo)記，局限SCLC患者Th17細胞數(shù)量高于廣泛轉(zhuǎn)移的SCLC患者。Th17細胞能誘導(dǎo)肺癌CD8+細胞毒性T淋巴細胞激活，發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)[17]。但我國近期的臨床研究[18,19]發(fā)現(xiàn)，Th17和IL-17在肺癌患者外周中均升高，并且隨著腫瘤的進展，數(shù)量逐漸升高。手術(shù)切除肺癌后患者Th17細胞和IL-17水平明顯下降。提示Th17細胞和IL-17是肺癌患者預(yù)后不良的指標(biāo)。我們的研究結(jié)果也顯示，Th17細胞和IL-17參與了肺癌腦轉(zhuǎn)移，屬于預(yù)后不良的指標(biāo)。

綜上所述，Th17細胞和IL-17可能參與了肺癌腦轉(zhuǎn)移的發(fā)生，對其進行深入研究有助于揭示Th17細胞在肺癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的機制，對于肺癌的診斷和免疫治療具有重要意義。