小劑量多西他賽持續(xù)化療聯(lián)合樹突狀細(xì)胞生物免疫治療抑制VEGF分泌

周嚴(yán) 王慧敏 鐘華

肺癌是我國(guó)最多發(fā)的一種惡性腫瘤，極易發(fā)生侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，約75%的患者就診時(shí)已處于晚期階段（III期或IV期），5年生存率僅為30%左右[1,2]，死亡率居惡性腫瘤死亡率首位。肺癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是造成其生存率低下的主要原因之一。因此，深入探討肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制，尋求有效抑制侵襲轉(zhuǎn)移的方法，是當(dāng)前焏待解決的問題。迄今針對(duì)腫瘤瘤體本身的傳統(tǒng)多學(xué)科綜合治療，如手術(shù)、放療、化療等，被證實(shí)無(wú)法突破決定肺癌患者生存的頸瓶—癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，我們需要重新審視傳統(tǒng)治療策略，尋找新的治療突破點(diǎn)。

小劑量持續(xù)化療聯(lián)合樹突狀細(xì)胞（dendritic cell, DC）的生物免疫治療是一種全新的治療模式，除了收獲小劑量持續(xù)化療本身抑制腫瘤新生血管的益處外[3,4]，還有望改變肺癌局部的微環(huán)境，而此種微環(huán)境中產(chǎn)生的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)有利于樹突狀細(xì)胞發(fā)揮免疫監(jiān)管的作用，兩種方法在肺癌的治療模式中將會(huì)產(chǎn)生互補(bǔ)和疊加的效應(yīng)。

本試驗(yàn)將利用負(fù)荷3LL肺癌細(xì)胞的C57/BL6J小鼠，應(yīng)用多西他賽的小劑量持續(xù)化療聯(lián)合樹突狀細(xì)胞的生物免疫治療方法，觀察聯(lián)合治療的抑瘤效應(yīng)和腫瘤微環(huán)境中與腫瘤新生血管生成相關(guān)的細(xì)胞因子分泌的變化。

1 材料與方法

1.1 材料 6周-8周齡的C57/BL6J小鼠為研究對(duì)象，雄性，質(zhì)量20 g左右，SPF級(jí)。動(dòng)物生產(chǎn)許可證SCXK（滬）2007-0001；動(dòng)物使用許可證 SCXK（滬）2008-0043。多西他賽，相對(duì)分子質(zhì)量為862，賽諾菲安萬(wàn)特公司產(chǎn)品；Lewis肺癌細(xì)胞（3LL）（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所）；鼠源性IL-4和GM-CSF（PeprTech）；液態(tài)芯片（Luminex）及試劑盒（BD）；微滲析儀及相關(guān)導(dǎo)管，探針及連接器。

1.2 方法

1.2.1 鼠源性DC的培養(yǎng) 第1天，培養(yǎng)鼠源性骨髓來(lái)源的DC：分離小鼠的股關(guān)節(jié)，取出兩條完整的自股關(guān)節(jié)到踝關(guān)節(jié)的肢體，針頭插入小鼠骨髓腔中，培養(yǎng)液沖洗。在細(xì)胞沉淀中依此加入紅細(xì)胞裂解液和抗體CD4、CD8、CD220以及補(bǔ)體，去除紅細(xì)胞及T、B淋巴細(xì)胞。將DC前體細(xì)胞放置于37oC培養(yǎng)箱中2 h，收集懸浮細(xì)胞，在懸浮細(xì)胞中按照GM-CSF 1 U/mL、IL-4 0.5 U/mL加入細(xì)胞因子。第6天，收獲培養(yǎng)的DC。

1.2.2 不同治療方式的建立 24只小鼠分別在皮下注射0.5×106個(gè)3LL腫瘤細(xì)胞；10 d后成瘤。測(cè)量小鼠體積，體積計(jì)算按照: 1/2長(zhǎng)徑×短徑2平衡各組小鼠體積后，隨機(jī)分4組：對(duì)照組（3LL）、DC免疫治療組（3LL+DC）、小劑量持續(xù)化療組（3LL+chemo）和DC免疫治療聯(lián)合小劑量化療組（3LL+DC+chemo）。四組治療的具體內(nèi)容如下：①3LL組：瘤內(nèi)注射PBS液10 μL；②3LL+DC組：腫瘤種植后11 d、15 d瘤內(nèi)注射2×106/50 μL DC皮下注入瘤內(nèi)DC；③3LL+chemo組：每周3次，每次0.2 mg/kg劑量瘤內(nèi)注射多西他賽；④3LL+DC+chemo組：瘤內(nèi)11 d、15 d注射2×106/50 μL DC皮下注入瘤內(nèi)DC，除此之外，每周3次，每次按照0.2 mg/kg劑量瘤內(nèi)注射多西他賽。繪制小鼠的生存曲線。

1.2.3 微滲析儀技術(shù)結(jié)合Luminex 技術(shù) 第22天時(shí)，各組小鼠中隨機(jī)取出一只放置于玻璃籠中，局麻下腫瘤內(nèi)置入探針，利用微泵將交換液泵入瘤體內(nèi)，活體狀態(tài)收集組織間液。小鼠保持清醒，在玻璃籠中正常進(jìn)食和活動(dòng)。應(yīng)用微滲析儀（Microdialysis）聯(lián)合液態(tài)芯片（Luminex）方法分析各組與腫瘤新生血管相關(guān)的細(xì)胞因子：人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，Oneway ANOVA法進(jìn)行組間比較，生存曲線采用Sigma Plot 11.0軟件，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組荷瘤小鼠的生存曲線 采用不同治療模式的小鼠生存時(shí)間如圖1所示，3LL+DC+chemo能延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存時(shí)間為（27.6±3.2）天，與3LL組（13.5±2.7）天、3LL+DC組（13.1±2.3）天、3LL+chemo組（11.8±3.0）天相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.008, P=0.01, P=0.01）。

2.2 各組治療組腫瘤內(nèi)部細(xì)胞因子分泌差異 采用微滲析儀聯(lián)合Luminex方法檢測(cè)各組荷瘤小鼠在不同時(shí)間分泌的細(xì)胞因子：bFGF（表1）和VEGF（圖2）的表達(dá)。結(jié)果顯示：bFGF的分泌在不同治療組的不同時(shí)段分泌的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而VEGF 的分泌在聯(lián)合治療組分別在48 h及72 h時(shí)有下降趨勢(shì)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

2004年Kerbel等[3]在Nature Rev Cancer雜志上報(bào)道，小劑量持續(xù)化療較之于傳統(tǒng)化療的優(yōu)勢(shì)是，在殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)，還能抑制癌周微環(huán)境中新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)。這種小劑量持續(xù)化療以投予頻繁的化療藥物與短暫休息間隔交替進(jìn)行為特點(diǎn)。其應(yīng)用于臨床最大的益處將是患者對(duì)此接受度高并且有很好的耐受性。多西他賽是一種新穎的細(xì)胞毒藥物，其作用機(jī)制是加強(qiáng)微管蛋白聚合作用和抑制微管解聚作用，導(dǎo)致穩(wěn)定的非功能性微管束形成，因而能破壞腫瘤細(xì)胞的有絲分裂。目前，多西他賽已經(jīng)成為肺癌患者化療的首選藥物。然而，在常規(guī)劑量下，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)強(qiáng)烈的副反應(yīng)，包括胃腸道、血液系統(tǒng)的毒副反應(yīng)，嚴(yán)重者甚至危及患者生命。因此，應(yīng)用小劑量持續(xù)療法，既能抑制腫瘤新生血管，又能起到減輕化療毒副反應(yīng)的作用是一種新穎的化療方法。

圖2 不同治療模式下腫瘤微環(huán)境中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）的分泌。3LL瘤體內(nèi)VEGF的分泌隨著腫瘤的生長(zhǎng)呈升高趨勢(shì)。各治療組內(nèi)的VEGF分泌較3LL組都有下降的趨勢(shì)。在3LL+DC+chemo組，這種抑制作用在48 h、72 h時(shí)最為明顯，與各組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Fig 2 VEGF secretion in tumor microenvironment in different treatments. With the growth of tumor, the secretion of VEGF in 3LL tumor increased. Compared with 3LL group, VEGF secretion was reduced in the other three groups. This inhibition presented obviously in 48 h and 72 h in metronomic chemotherapy combination with DC vaccine group, compared with other groups, P＜0.05.

表1 不同治療模式下腫瘤微環(huán)境中bFGF的分泌Tab 1 bFGF secretion in tumor microenvironment in different treatments

DC是唯一能向初始T細(xì)胞遞呈抗原，并激發(fā)T細(xì)胞及B細(xì)胞免疫應(yīng)答的、功能最強(qiáng)的專職性抗原遞呈細(xì)胞，在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)，尤其在啟動(dòng)抗腫瘤免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。DC激發(fā)免疫反應(yīng)有如下特點(diǎn)：①極少量的DC就能激發(fā)強(qiáng)大的T細(xì)胞免疫應(yīng)答；②可以激活靜止?fàn)顟B(tài)的T細(xì)胞群；③在體內(nèi)可以同時(shí)致敏CD4+T輔助細(xì)胞和CD8+T殺傷細(xì)胞[5,6]。但目前單純應(yīng)用DC免疫治療肺癌尚未獲得預(yù)期的療效，究其原因，可能是以DC為基礎(chǔ)的免疫生物療法的有效性更多地體現(xiàn)在改變腫瘤局部的微環(huán)境，防治腫瘤轉(zhuǎn)移，從而提高荷瘤宿主的帶瘤生存期，而不是直接的殺瘤效應(yīng)[7,8]。因此，我們?cè)O(shè)想，如能以多西他賽小劑量持續(xù)化療法聯(lián)合DC免疫生物療法，可望獲得更強(qiáng)大的抗肺癌效果。在此試驗(yàn)中，我們應(yīng)用荷瘤動(dòng)物驗(yàn)證我們的想法。

VEGF是在促進(jìn)腫瘤血管生成中起主要作用的細(xì)胞因子，促腫瘤血管生成的其他因子如人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）、血小板源性生長(zhǎng)因子（platelet derived growth factor, PDGF）、腫瘤壞死因子α（tumor nectosis factor-α, TNF-α）、表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor, EGF）等，這些生長(zhǎng)因子其作用主要通過誘導(dǎo)VEGF表達(dá)實(shí)現(xiàn)促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的作用。VEGF及其受體信號(hào)通路激活可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞存活、增殖與遷移，也可促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞被招募至血管生成活躍部位。腫瘤血管生成是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，VEGF、bFGF對(duì)血管生成的多個(gè)環(huán)節(jié)，如血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、分化、遷移和管腔狀結(jié)構(gòu)的形成、血管內(nèi)皮基底膜的降解等均有明顯的促進(jìn)作用。VEGF及其受體的表達(dá)還受到bFGF的調(diào)控，bFGF在體內(nèi)外均能誘導(dǎo)VEGF的合成，還能上調(diào)VEGF受體Flk-l的表達(dá)。

我們的試驗(yàn)結(jié)果顯示：小劑量持續(xù)化療聯(lián)合樹突狀細(xì)胞生物免疫治療能夠延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存，一定程度上在于聯(lián)合治療抑制瘤內(nèi)VEGF的分泌，可能通過瘤體內(nèi)VEGF的抑制產(chǎn)生了抑制腫瘤新生血管的形成。除此之外，小劑量持續(xù)化療聯(lián)合樹突狀細(xì)胞生物免疫治療比之于單一的治療方式獲得生存獲益的原因在于化療本身刺激了腫瘤抗原的廣泛釋放，刺激了免疫細(xì)胞發(fā)揮強(qiáng)大的抗原提呈作用。更多的內(nèi)在機(jī)制需要大樣本的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。