磁性殼聚糖微球固定化米糠內(nèi)源酶的研究

張媛媛 張 暉 王 立 錢海峰 齊希光

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

谷氨酸脫羧酶（GAD）作為米糠內(nèi)源酶，可以專一的催化谷氨酸或其鈉鹽脫羧轉(zhuǎn)化為γ－氨基丁酸（GABA）。而γ－氨基丁酸作為一種重要的中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制劑，具有多種重要的生理功能［1］，如降血壓、治癲癇、抗衰老、調(diào)節(jié)激素等。鑒于游離酶不便于重復(fù)利用，而與游離酶相比，固定化酶便于回收以重復(fù)利用，且相對容易分離，故越來越多的研究轉(zhuǎn)向固定化酶。如今，固定化酶的技術(shù)迅速發(fā)展，在多個領(lǐng)域都得到了較為廣泛的應(yīng)用，如食品、醫(yī)藥、化工等［2，3］。磁性殼聚糖微球作為固定化酶的一種載體，現(xiàn)已被用于果膠酶、谷氨酰胺酶、漆酶、褐藻酸酶、乳糖酶、辣根過氧化物酶、脂肪酶等的固定化［4，5］。

關(guān)于谷氨酸脫羧酶的固定化，已有的報道［6，7］多是以海藻酸鈉、殼聚糖作為載體，使得制備的GABA溶液中鹽含量較高，且需離心操作，分離較繁瑣，后期的純化工作復(fù)雜，故尋找更好的固定化酶載體成為人們研究的熱點。用磁性殼聚糖微球作為載體，可以利用外界磁場的作用，簡單分離，重復(fù)利用，以有效的避免上述問題。然而目前還沒有用磁性殼聚糖固定化谷氨酸脫羧酶的報道。

本試驗以Fe3O4作為磁性內(nèi)核，殼聚糖作為外殼，采用乳化交聯(lián)法來制備磁性殼聚糖微球，以此為載體來固定化谷氨酸脫羧酶，并研究固定化谷氨酸脫羧酶的酶學(xué)性質(zhì)，旨在尋求一種能方便有效、且成本低廉或適中的固定化谷氨酸脫羧酶的方法，為更好的利用GAD的酶活力提供相關(guān)的理論分析和數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要材料與試劑

新鮮米糠：無錫市蘇惠米業(yè)有限公司；

Fe3O4：北京德科島金科技有限公司；

PLP、PMSF、GABA：美國Sigma公司；

2－巰基乙醇、殼聚糖：中國醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑公司；

磁鐵：友磁實業(yè)有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

超低溫冰箱：FORMA 702型，美國 Thermo life Sciences公司；

冷凍干燥機(jī)：LGJ－10型，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；

高速冷凍離心機(jī)：CR21GⅢ型，日本Hitachi Koki公司；

定時恒溫磁力攪拌器：90－2型，上海滬西分析儀器廠；

傅里 葉 變 換 紅 外 光 譜 儀 （Nicolet Nexus FT－IR spectrometer）：470FT－IR型，美國 Thermo Electron公司；

高速臺式離心機(jī)：TGL－IGC型，上海安亭科學(xué)儀器廠；

超級恒溫水?。篗P－501A型，上海市實驗儀器廠；

高效液相色譜儀（配有可變波長紫外檢測器）：Agilent 1100型，美國Agilent公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 米糠谷氨酸脫羧酶的制備 參照文獻(xiàn)［8］，以料液比1∶4（m∶V）用緩沖液在4℃下提取米糠谷氨酸脫羧酶1h。其中，緩沖液為含有2mmol／L EDTA－二鈉、2mmol／L 2－巰基乙醇、1mmol／L PLP、1mmol／L PMSF 和 10% 甘 油 的0.05mol／L（pH＝5.6）Na2HPO4－NaH2PO4緩沖液。采用硫酸銨沉淀法從提取液中得到谷氨酸脫羧酶，之后在標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中透析至無NH＋4，冷凍干燥后凍藏備用。

1.2.2 米糠谷氨酸脫羧酶活性的測定 用0.05mol／L（pH＝5.6）PBS緩沖液對谷氨酸脫羧酶進(jìn)行復(fù)溶，制備蛋白含量約為1mg／mL的酶液，加入0.05mol／L谷氨酸鈉作為底物，40℃下反應(yīng)2h，在90℃下滅酶5min，離心取上清液測定產(chǎn)物GABA的含量。其中GABA含量用高效液相色譜法［9］測定。以每30min生成1μmol的GABA作為一個酶活力單位。

1.2.3 米糠谷氨酸脫羧酶活力回收率的計算

1.2.4 磁性殼聚糖的制備及表征 參考文獻(xiàn)［10］，取0.5g Fe3O4微粒與20mL 2.5%殼聚糖乙酸溶液混合，超聲使其充分混勻，然后在攪拌下緩慢加入到80mL液體石蠟和4mL Span－80混合溶液中，常溫攪拌30min后，加入10mL 8%戊二醛，40℃恒溫水浴中攪拌1h，用1mol／L氫氧化鈉溶液將pH調(diào)至9～10，70℃恒溫水浴中繼續(xù)攪拌2h，用磁鐵吸出微球，并先后用石油醚、丙酮、蒸餾水反復(fù)洗滌，冷凍干燥得到磁性殼聚糖微球。采用激光粒度分析儀來測定磁性微球的粒徑，而采用KBr粉末壓片，用紅外光譜儀測定其官能團(tuán)的特征吸收。

1.2.5 磁性微球固定化米糠谷氨酸脫羧酶的基本方法 取0.05g制備的磁性殼聚糖微球，加入到25mL錐形瓶中，用不同pH的磷酸鹽緩沖液溶脹過夜，加入一定濃度的戊二醛溶液進(jìn)行交聯(lián)，用磁鐵吸出磁性殼聚糖微球，用磷酸鹽緩沖液清洗至檢測不出戊二醛。加入一定濃度的谷氨酸脫羧酶液，在4℃下固定一定時間，用磁鐵吸出磁性殼聚糖微球后，再用磷酸鹽緩沖液將微球充分洗滌。得到的固定化谷氨酸脫羧酶于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 磁性微球固定化米糠谷氨酸脫羧酶的條件優(yōu)化研究

（1）緩沖液pH：控制戊二醛濃度為2%，交聯(lián)時間為4h，固定時間為3h，考察pH 為4.8，5.2，5.6，6.0，6.4時的酶活力回收率。

（2）戊二醛濃度：控制緩沖液pH為5.6，交聯(lián)時間為4h，固定時間為3h，考察戊二醛濃度為 1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%時的酶活力回收率。

（3）交聯(lián)時間：控制緩沖液pH為5.6，戊二醛濃度為2%，固定時間為3h，考察交聯(lián)時間為2，3，4，5，6h時的酶活力回收率。

（4）固定時間：控制緩沖液pH為5.6，戊二醛濃度為2%，交聯(lián)時間為4h，考察固定時間為1，2，3，4，5h時的酶活力回收率。

（5）正交試驗：以單因素試驗的研究結(jié)果為基礎(chǔ)，設(shè)計L9（34）正交試驗。

1.2.7 固定化米糠谷氨酸脫羧酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

（1）最適溫度：取等量的游離和固定化谷氨酸脫羧酶，加入含有底物的PBS緩沖液中，于30，35，40，45，50℃下100r／min水浴振蕩制備GABA。

（2）熱穩(wěn)定性：取等量的游離和固定化谷氨酸脫羧酶，浸泡在PBS緩沖液中，在30，35，40，45，50，55，60，65，70 ℃精確保溫30min后，取出后迅速冷卻至室溫，換入新的含底物的PBS緩沖液，游離酶于40℃、固定化酶于45℃下100r／min水浴振蕩制備GABA。

（3）最適pH：取等量的游離和固定化谷氨酸脫羧酶，加入含有底物的pH 為4.8，5.2，5.6，6.0，6.4的 PBS緩沖液中，于最適溫度下100r／min水浴振蕩制備GABA。

（4）pH穩(wěn)定性：取等量的固定化谷氨酸脫羧酶，分別加入pH 為4.8，5.2，5.6，6.0，6.4的 PBS緩沖液中于4℃冰箱里放置24h，取出后對微球進(jìn)行清洗，換入新的含有底物的PBS緩沖液，于45℃下100r／min水浴振蕩制備GABA。

（5）操作穩(wěn)定性：取固定化谷氨酸脫羧酶，加入含有底物的PBS緩沖液中，于45℃下100r／min水浴振蕩制備GABA。15h后取出微球，換入新的含有底物的PBS緩沖液，繼續(xù)反應(yīng)直至酶活力為零。

（6）貯藏穩(wěn)定性：每天取等量的固定化谷氨酸脫羧酶，加入含有底物的PBS緩沖液中，于45℃下100r／min水浴振蕩制備GABA。

2 結(jié)果與討論

2.1 磁性殼聚糖的表征

圖1是殼聚糖和磁性殼聚糖微球的紅外光譜圖。殼聚糖圖譜在3 430cm－1處有紅外吸收峰，這是－NH2和－OH的伸縮振動，在2 870cm－1和2 930cm－1處有脂肪族C－H的伸縮振動吸收，在1 090cm－1處有C－O的伸縮振動吸收。與殼聚糖圖譜相比，磁性殼聚糖微球圖譜雖響應(yīng)值有所變化，但殼聚糖的特征吸收峰都得到了保留，而且在3 430cm－1處的吸收峰較寬，這表明在磁性殼聚糖微球中存在著增強(qiáng)的氫鍵作用，而在573cm－1出的紅外吸收峰應(yīng)是磁性內(nèi)核的Fe－O特征吸收峰，從而表明Fe3O4和殼聚糖之間存在著分子間的相互作用，因此認(rèn)為殼聚糖和磁性微球的乳化交聯(lián)是成功的。

圖1 殼聚糖和磁性殼聚糖微球的紅外光譜圖Figure 1 Infrared Spectroscopy result of chitosan and magnetic chitosan microspheres

2.2 固定化米糠谷氨酸脫羧酶的條件優(yōu)化

考察了緩沖液pH、戊二醛濃度、交聯(lián)時間和固定時間4個因素對谷氨酸脫羧酶的固定化影響，根據(jù)單因素試驗結(jié)果，得到的正交試驗因素水平取值見表1，試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。由表2可知，各因素對于酶活力回收率的影響順序為A＞C＞D＞B，谷氨酸脫羧酶固定化的最優(yōu)條件為A2B2C1D3，即pH為5.2，戊二醛濃度為1.5%，交聯(lián)時間為4h，固定時間為5h。以此條件進(jìn)行驗證實驗，得到酶活力回收率為39.41%。

表1 谷氨酸脫羧酶的固定化條件正交試驗因素水平表Table 1 Factors－levels of the orthogonal test for immobilization of GAD

2.3 固定化米糠谷氨酸脫羧酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 固定化米糠谷氨酸脫羧酶的最適溫度 由圖2可知，固定化谷氨酸脫羧酶的最適溫度由游離時的40℃向右偏移到45℃，這是因為谷氨酸脫羧酶在固定化后，載體存在著一定的傳質(zhì)阻力，而底物需要更多的能量來與谷氨酸脫羧酶結(jié)合，從而增強(qiáng)了酶的耐熱性。而后繼續(xù)升高反應(yīng)溫度時，谷氨酸脫羧酶會發(fā)生部分變性失活，從而使酶活力下降。

表2 谷氨酸脫羧固定化條件正交試驗結(jié)果Table 2 Results of the orthogonal test for immobilization of glutamate decarboxylase

圖2 溫度對游離及固定化的谷氨酸脫羧酶活力的影響Figure 2 Effect of temperature on the activities of free and immobilized glutamate decarboxylase

2.3.2 固定化米糠谷氨酸脫羧酶的熱穩(wěn)定性研究 由圖3可知，當(dāng)處理溫度低于45℃時，隨著處理溫度的升高，游離酶和固定化酶的酶活力回收率都增大。這與前人的研究結(jié)果［11］——當(dāng)植物受到外界的刺激，比如溫度升高時，體內(nèi)谷氨酸脫羧酶活力會有所提升相一致。而隨著溫度繼續(xù)升高，由于谷氨酸脫羧酶發(fā)生部分熱變性，即便之后在相同的溫度下制備GABA，其酶活力都相應(yīng)的逐漸降低。

2.3.3 固定化米糠谷氨酸脫羧酶的最適pH 由圖4可知，游離酶的最適pH為5.6，而固定化后，酶的最適pH向左移動至5.2，這可能是因為磁性殼聚糖微球表面的帶電基團(tuán)與谷氨酸脫羧酶的結(jié)合，導(dǎo)致其微環(huán)境遭到改變，從而影響了固定化谷氨酸脫羧酶的最適pH，使其更適合酸性環(huán)境，這樣可以相對減少在制備GABA的過程中微生物對反應(yīng)的影響。

圖3 不同溫度處理對游離及固定化的谷氨酸脫羧酶活力的影響Figure 3 Effect of different temperature treatment on the activities of free and immobilized glutamate decarboxylase

圖4 pH對游離及固定化的谷氨酸脫羧酶活力的影響Figure 4 Effect of pH on the activities of free and immobilized glutamate decarboxylase

2.3.4 固定化米糠谷氨酸脫羧酶的pH穩(wěn)定性研究 由圖5可知，游離谷氨酸脫羧酶隨著處理pH值的增大，其酶活力回收率有先增大后降低的趨勢，而固定化后其酶活力回收率一直降低，這說明固定化后谷氨酸脫羧酶的耐酸能力變強(qiáng)。這可能是因為磁性殼聚糖微球作為固定化的載體，能為谷氨酸脫羧酶營造一個較為穩(wěn)定的微觀環(huán)境，且殼聚糖帶有大量的氨基和羧基等基團(tuán)，對酸和堿有一定的緩沖作用，兩方面的共同作用使固定化谷氨酸脫羧酶的耐酸能力增強(qiáng)。

圖5 不同pH處理對固定化谷氨酸脫羧酶活力影響Figure 5 Effect of different pH treatment on the activities of immobilized glutamate decarboxylase

2.3.5 固定化米糠谷氨酸脫羧酶的操作穩(wěn)定性研究 由圖6可知，固定化谷氨酸脫羧酶活力的衰減速度較快，其半衰期約為50h，與王筱婧等［12］用海藻酸鈉固定化米糠中谷氨酸脫羧酶的半衰期結(jié)果相一致。這可能是因為在每次反應(yīng)結(jié)束后的清洗過程中，容易造成酶活力的損失。因此可適當(dāng)增加每次反應(yīng)的時間，或者進(jìn)行連續(xù)反應(yīng)，以最大程度的利用固定化谷氨酸脫羧酶。

圖6 固定化谷氨酸脫羧酶的操作穩(wěn)定性Figure 6 Operation stability of immobilized glutamate decarboxylase

2.3.6 固定化米糠谷氨酸脫羧酶的貯藏穩(wěn)定性研究 對固定化谷氨酸脫羧酶的貯藏穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，由圖7可知，固定化谷氨酸脫羧酶在經(jīng)過30d的貯藏后，其酶活力回收率依舊能保持在原來的70%左右。這說明經(jīng)過固定化后，谷氨酸脫羧酶在低溫（4℃）貯藏的狀態(tài)下，其酶活力穩(wěn)定性能保持較高水平。

圖7 固定化谷氨酸脫羧酶的貯藏穩(wěn)定性Figure 7 Storage stability of immobilized glutamate decarboxylase

3 結(jié)論

本試驗考察了磁性殼聚糖微球固定谷氨酸脫羧酶時緩沖液pH、戊二醛濃度、交聯(lián)時間和固定時間等因素對固定化效果的影響。研究得到固定谷氨酸脫羧酶的最優(yōu)條件：在pH為5.2的緩沖液中充分溶脹后，加入1.5%的戊二醛溶液交聯(lián)3h后，加入酶液固定4h，得到固定化酶活力回收率為39.41%。通過對固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)的研究，得到固定化后，谷氨酸脫羧酶的耐酸性和耐熱性得到了提高，貯藏穩(wěn)定性也能在一定時間內(nèi)保持較高水平。

本法較之前的固定方法，制備工藝簡單，具備工業(yè)化應(yīng)用的前景；且固定化酶在制備GABA時能簡單分離，方便重復(fù)利用，后期的純化工藝也相對簡單。但要連續(xù)反應(yīng)需進(jìn)一步研究其再生方法，從而進(jìn)一步提高酶的催化反應(yīng)效率。

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