重組草酸脫羧酶的表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究*

林日輝，許麗莉，農(nóng)勉，張陸成

(廣西民族大學(xué)化學(xué)與生態(tài)工程學(xué)院，化學(xué)與生物轉(zhuǎn)化過程新技術(shù)廣西高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧，530006)

重組草酸脫羧酶的表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究*

林日輝，許麗莉，農(nóng)勉，張陸成

(廣西民族大學(xué)化學(xué)與生態(tài)工程學(xué)院，化學(xué)與生物轉(zhuǎn)化過程新技術(shù)廣西高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧，530006)

研 究了重組草酸脫羧酶的表達(dá)及其酶學(xué)性質(zhì)。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，每克濕重菌體收獲草酸脫羧酶活力820 U，經(jīng)Ni－NTA親和層析酶液純化2.07倍，酶活力回收60.38%。酶促反應(yīng)的最適溫度為50～55℃，最適pH值為3.5，添加EDTA及Fe2+對(duì)酶活力有促進(jìn)作用，Mn2+抑制酶活。在pH4.0，溫度37℃下Km值為14.53 mmol/l，Vmax 為 1 33.33 U/mg。

草 酸脫羧酶，誘導(dǎo)表達(dá)，純化，酶學(xué)性質(zhì)

1 材料與方法

1.7 蛋白濃度和酶活力測(cè)定

蛋白濃度采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定。

草酸脫羧酶活力測(cè)定采用終止反應(yīng)法［12］。反應(yīng)液含 0.115 mol/L 草 酸 鉀，80 μmol/L MnCl2，50 mmol/L pH值4.0檸檬酸緩沖液，加入草酸脫羧酶液開始反應(yīng)，10 min后加入等體積的 0.2 mol/L K2HPO4終止反應(yīng)。過0.20 μm微孔膜除去酶蛋白，采用液相色譜法(HPLC)檢測(cè)反應(yīng)生成的甲酸。色譜柱為 Aminex○Rresin－based 87H 柱，柱溫 65 ℃;流動(dòng)相為 0.004 mol/L H2SO4，流速 0.6 mL/min;紫外檢測(cè)器210 nm檢測(cè);進(jìn)樣量20 μL。酶活單位定義為:每分鐘催化轉(zhuǎn)化草酸產(chǎn)生1 μmol甲酸的酶量。

1.8 酶學(xué)性質(zhì)

以純化的草酸脫羧酶為對(duì)象，分別研究其最適pH值和pH穩(wěn)定性、最適溫度和熱穩(wěn)定性、金屬離子和EDTA對(duì)酶活力的影響，以及草酸脫羧酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 草酸脫羧酶的表達(dá)、純化

經(jīng)IPTG誘導(dǎo)及破碎細(xì)胞提取后，每克濕重菌體細(xì)菌收獲草酸脫羧酶活力820 U(比活力1.82 U/mg)。層析分離結(jié)果如圖1所示。

圖1 酶粗提液親和層析洗脫曲線

由圖1可見，粗提液中蛋白按無吸附、弱吸附、較強(qiáng)吸附3階段洗出。酶活檢測(cè)表明，草酸脫羧酶酶活存在于強(qiáng)吸附的分級(jí)收集液中。這是由于重組草酸脫羧酶具有6個(gè)組氨酸標(biāo)志，與層析柱Ni2+吸附較強(qiáng)。部分分級(jí)洗脫液 SDS－PAGE結(jié)果見圖2。SDSPAGE表明重組草酸脫羧酶亞基分子量約44 ku，與文獻(xiàn)報(bào)道相符［9］。粗酶液經(jīng) Ni－NTA親和層析一步純化，草酸脫羧酶比活提高2.07倍，酶活回收為60.38%。SDS－PAGE 結(jié)果也表明，Ni－NTA 親和層析純化酶液中尚有少量雜質(zhì)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)需采用其他手段(如凝膠過濾)進(jìn)一步純化。

圖2 親和層析分級(jí)酶液SDS－PAGE圖

2.2 HPLC法檢測(cè)甲酸

本研究涉及金屬離子和不同pH對(duì)草酸脫羧酶的影響，文獻(xiàn)中大多報(bào)道利用甲酸脫氫酶偶聯(lián)法檢測(cè)草酸脫羧酶催化生成的甲酸，該法的分析結(jié)果可能會(huì)受到第一個(gè)反應(yīng)的pH或金屬離子影響。為了避免干擾，采用HPLC直接檢測(cè)。HPLC對(duì)草酸脫羧酶催化反應(yīng)液的分離及檢測(cè)結(jié)果見圖3。可見草酸脫羧酶催化反應(yīng)體系簡(jiǎn)單，通過HPLC可以有效分離產(chǎn)物甲酸(13.274 min)、反應(yīng)物草酸(6.876 min)、緩沖劑檸檬酸(7.685 min)。實(shí)驗(yàn)還對(duì)比了HPLC法和甲酸脫氫酶法對(duì)甲酸定量檢測(cè)的準(zhǔn)確度，HPLC法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值、線性回歸方程確定系數(shù)R2值都優(yōu)于酶偶聯(lián)法，只是檢測(cè)耗時(shí)較長(zhǎng)。

圖3 HPLC對(duì)草酸脫羧酶催化反應(yīng)液的分離

2.3 草酸脫羧酶的基本特性

2.3.1 最適pH值和pH穩(wěn)定性

由圖4(A)可知，草酸脫羧酶適宜反應(yīng)pH偏酸性，最適pH值為3.5。當(dāng)pH值＞4.5時(shí)酶促反應(yīng)速度隨pH下降，pH值6.5時(shí)酶活基本喪失。圖4(B)表明，酸性條件不利于保持草酸脫羧酶的活性。在弱酸性(pH值4.5～6.5)37℃水浴靜置6h后，草酸脫羧酶殘余活性達(dá)93.5% ～98.7%;但在pH值3.5條件下，酶活僅剩4.1%。實(shí)驗(yàn)曾以50 mmol/L的pH值8.0磷酸鹽緩沖液在4℃保存草酸脫羧酶30 d，酶活力無顯著損失(剩余活性大于97%)。

圖4 pH值對(duì)草酸脫羧酶活力影響

2.3.2 草酸脫羧酶的最適溫度和熱穩(wěn)定性

如圖5(A)所示，在pH值4.0時(shí)，草酸脫羧酶具有較寬的催化溫度范圍，但熱穩(wěn)定性較差［圖5(B)］。在45～55℃，酶的活性達(dá)到最高，相對(duì)酶活力超過90%。在37℃溫浴保存60 min，酶活僅損失了3.3%;而在50℃，酶活損失隨時(shí)間延長(zhǎng)呈線性上升;60℃下處理10 min，酶活僅剩12.7%，60 min酶活已基本喪失?？梢娸^高溫度(50～55℃)雖然加速了酶促反應(yīng)，但也加速了酶結(jié)構(gòu)的破壞。在應(yīng)用中采用35～40℃，可獲得較高的相對(duì)酶活(大于64%)，又可避免酶失活。

圖5 溫度對(duì)草酸脫羧酶活力的影響

2.3.3 金屬離子和EDTA對(duì)酶活力的影響

在1 mmol/L的濃度下，金屬離子和EDTA對(duì)草酸脫羧酶活的影響見圖6(A)。其中EDTA及Fe2+使酶活力分別提高了9.26%和26.59%;令人感興趣的是:Mn2+使酶活力降低了54.21%;其他測(cè)試離子對(duì)草酸脫羧酶活力影響不顯著。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察了0.1～10 mmol/L濃度Mn2+對(duì)草酸脫羧酶的影響(圖6B)，結(jié)果表明，測(cè)試濃度范圍內(nèi)的外加Mn2+對(duì)草酸脫羧酶活力的都具抑制作用，低Mn2+濃度下(0.1～0.5 mmol/L)，相對(duì)酶活力隨Mn2+濃度提高而下降。

圖6 金屬離子和EDTA對(duì)草酸脫羧酶活力影響

2.3.4 動(dòng)力學(xué)常數(shù) Km 及 Vmax的測(cè)定

以 1.13、2.26、4.52、5.66、11.31、22.62、45.25、67.87 mmol/L濃度草酸鉀為底物，測(cè)定對(duì)應(yīng)的酶促反應(yīng)速度，用Hanes－Woolf作圖法(圖7)求出草酸脫羧酶的 Km 值為14.53 mmol/L，Vmax為133.33 U/mg。

圖7 草酸濃度與酶促反應(yīng)速度的關(guān)系

3 討論

Mn2+是草酸脫羧酶的組成成分，每個(gè)酶亞基分別在N端和C端結(jié)構(gòu)域中各結(jié)合1個(gè)Mn2+。對(duì)草酸脫羧酶催化機(jī)理研究表明，活性中心Mn2+的作用直接導(dǎo)致草酸分子 C－C 鍵的異裂［10，12］。然而，反應(yīng)體系中添加Mn2+對(duì)草酸脫羧酶產(chǎn)生抑制作用，目前未見文獻(xiàn)報(bào)道。結(jié)合添加Mn2+對(duì)酶產(chǎn)生抑制，而添加1 mmol/L的EDTA提高酶活力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)草酸脫羧酶分子上除了N端和C端活性結(jié)構(gòu)域可以緊密結(jié)合Mn2+外，還有其他部位可以與Mn2+以較弱鍵的方式結(jié)合，這種結(jié)合可能改變酶的構(gòu)象而產(chǎn)生抑制作用;由于在誘導(dǎo)表達(dá)過程中使用了濃度為5 mmol/L的Mn2+，其中部分Mn2+以較弱鍵結(jié)合于酶活性結(jié)構(gòu)域以外的部位，當(dāng)反應(yīng)液中存在離子螯合劑EDTA時(shí)，這部分Mn2+得以從酶分子上清除，從而提高了相對(duì)酶活。

實(shí)驗(yàn)利用原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)草酸脫羧酶進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，每升發(fā)酵液收獲草酸脫羧酶活力1 640 U(約12.33 mg酶蛋白)，遠(yuǎn)高于野生菌的誘導(dǎo)表達(dá)量［13］。草酸脫羧反應(yīng)是消耗質(zhì)子的過程，一定酸度的反應(yīng)體系利于脫羧的進(jìn)行，重組草酸脫羧酶適宜反應(yīng)pH偏酸性(pH值3.5～4.5)，與絲狀真菌來源的草酸脫羧酶相似［14］;但在pH值3.5下酶活力損失嚴(yán)重，應(yīng)用中選擇pH值4.5的反應(yīng)條件較有利。草酸脫羧酶最適溫度在50～55℃，但該溫度不利于酶的穩(wěn)定，在實(shí)際應(yīng)用中采用35～40℃，可獲得較高的相對(duì)酶活(大于64%)，也避免了高溫對(duì)酶結(jié)構(gòu)的破壞。草酸脫羧酶在pH值8.0，4℃下可以較長(zhǎng)時(shí)間保存，其最大酶促反應(yīng)速度達(dá)133.33 U/mg。上述結(jié)果可為草酸脫羧酶的應(yīng)用提供依據(jù)。

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Expression and Characterization of Oxalate Decarboxylase

Lin Ri－h(huán)ui，Xu Li－li，Nong Mian，Zhang Lu－cheng
(Key Laboratory of New Techniques for Chemical and Biological Conversion Process，College of Chemistry and Ecological Engineering，Guangxi University for Nationalities，Nanning 530006，China)

Oxalate decarboxylase was expressed and characterized in this paper.After induced by IPTG，820 U/g(wet weight)of oxalate decarboxylase was obtained，and the enzyme was purified 2.07 fold by metal chelate affinity chromatography with a yield of 60.38%.The enzyme had an optimum temperature between 50 and 55 ℃，and optimum pH at 3.5.Addition of EDTA or Fe2+would activate oxalate decarboxylase，but addition of Mn2+would inhibit the enzyme.Under condition of pH4.0，37 ℃，the enzyme’s Kmwas 14.53 mmol/l with Vmax=133.33 U/mg.

oxalate decarboxylase，expression，purification，characterization

草酸脫羧酶(EC 4.1.1.2)催化轉(zhuǎn)化草酸為甲酸和CO2，是植物、微生物中草酸代謝降解的主要催化酶之一［1］。草酸脫羧酶目前已用于醫(yī)療檢測(cè)草酸含量，在食品、工業(yè)、農(nóng)業(yè)領(lǐng)域也具有廣闊的應(yīng)用前景。將草酸脫羧酶制成口服制劑可用于減輕控制尿石癥［2］;構(gòu)建含草酸脫羧酶基因的乳酸菌可作為益生菌用于防止高草酸尿癥［3］;草酸脫羧酶用于造紙制漿過程可降低流程設(shè)備結(jié)垢的風(fēng)險(xiǎn)［4－5］;構(gòu)建含草酸脫羧酶的轉(zhuǎn)基因作物不但可以降低作物草酸含量，改善作物品質(zhì)，還可提高作物對(duì)病原真菌的抗病力［6－7］。

目前，已有關(guān)于草酸脫羧酶酶學(xué)性質(zhì)的研究［8－9］。然而，由于菌株來源及檢測(cè)方法差異，報(bào)道的結(jié)果差異較大;此外，金屬離子對(duì)酶的影響都是以誘導(dǎo)表達(dá)狀態(tài)下添加不同離子進(jìn)行分析［10－11］，金屬離子對(duì)酶促反應(yīng)的直接影響未見報(bào)道。本研究在原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)B.subtilis來源的草酸脫羧酶進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，利用親和層析一步純化，獲得純度較高的重組酶;采用HPLC分析酶活的方法，研究了重組草酸脫羧酶的酶學(xué)性質(zhì)。本研究為深入研究草酸脫羧酶的催化機(jī)理，擴(kuò)大其應(yīng)用領(lǐng)域提供依據(jù)。

1.1 菌種

基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET32a/YvrK由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基組成:1 L培養(yǎng)基含蛋白胨10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 10 g，pH7.0。固體培養(yǎng)基添加 18 g瓊脂粉。

1.3 試劑

草酸鉀、甲酸鈉、甲酸脫氫酶，購自Sigma公司;HisTrap HP親和柱、PD－10脫鹽柱為Amersham產(chǎn)品;IPTG、NAD+、胺芐青霉素購自上海生工;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.4 主要儀器及設(shè)備

液相色譜儀(日本島津);凝膠成像系統(tǒng)(美國伯樂);快速蛋白液相色譜系統(tǒng)(美國通用);紫外分光光度計(jì)(上海普析)。

1.5 草酸脫羧酶的表達(dá)

將基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET32a/YvrK培養(yǎng)至 OD600為0.4時(shí)，42℃熱沖擊 5 min，加人5 mmol/L MnCl2，0.4 mmol/L IPTG，誘導(dǎo)表達(dá) 4 h 后，離心收集菌體，以pH8.0磷酸鹽緩沖液重懸菌體，超聲破碎收集上清為粗酶液。

1.6 草酸脫羧酶的純化

使用AKTA－FPLC系統(tǒng)進(jìn)行酶純化。先以5倍柱床體積 A緩沖液(含20 mmol/L咪唑，0.5 mol/L NaCl，50 mmol/L的pH8.0磷酸鹽緩沖液)平衡柱床。粗酶液過0.2 μm孔徑膜后上柱，按以下程序洗脫:含0%的 B緩沖液(含20 mmol/L咪唑，0.5 mol/L NaCl，50 mmol/L的 pH8.0磷酸鹽緩沖液)沖洗 75 mL，含10%的 B緩沖液沖洗40 mL，B液10%至100%線性梯度洗脫50 mL。洗脫流速為l mL/min。分級(jí)酶液利用SDS－PAGE進(jìn)行分析鑒定。

收集分級(jí)酶液經(jīng)超濾濃縮后，使用PD－10柱脫鹽。根據(jù)使用說明，先以50 mmol/L的pH8.0磷酸鹽緩沖液平衡20 mL，上樣2.5 mL，待樣品全部進(jìn)入柱床，加入緩沖液洗脫，收集前3 mL洗脫液即為脫鹽的草酸脫羧酶。

博士，副教授(Email:linrihui_0@yahoo.com.cn)。

*廣西民族大學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目科研基金(200701YJ01)，化工過程創(chuàng)新技術(shù)研發(fā)平臺(tái)建設(shè)(桂科能0992028－13)資助課題。

2010－10－06，改回日期:2010－12－01