魷魚足酶法去皮工藝的優(yōu)化

王麗麗 楊憲時(shí) 李學(xué)英 遲 海

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；2.大連海洋大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 大連 116023）

魷魚又名柔魚、槍烏賊，軟體動(dòng)物類，是目前世界上最具開發(fā)潛力的大洋海產(chǎn)品之一［1］。魷魚不僅捕獲量大，而且營養(yǎng)豐富，含有15%～19%的蛋白質(zhì)，11%～15%的脂肪，及鈣、磷、硒、錳、銅等礦物質(zhì)［2］。魷魚可食部分達(dá)80%以上，是可利用率較高的肉類資源。近年受全球經(jīng)濟(jì)下滑的影響，國際魷魚市場疲軟，魷魚鮮銷量直線下跌，而魷魚加工產(chǎn)業(yè)卻快速發(fā)展起來［3］。但是一直以來魷魚的加工利用基本停留在其胴體上，足、耳、內(nèi)臟等一些加工副產(chǎn)物則作為低價(jià)副產(chǎn)品被加工成飼料或扔掉［4］。其中魷魚足表皮層厚，顏色深黑且吸盤不易去除，其去皮問題一直是魷魚加工企業(yè)較難解決的問題。有學(xué)者［5］通過單因素試驗(yàn)或者單因素結(jié)合正交試驗(yàn)研究過魷魚胴體酶法去皮工藝，雖然去皮效果理想，但是由于魷魚足質(zhì)地、結(jié)構(gòu)的特殊性，其工藝不適合應(yīng)用在魷魚足去皮環(huán)節(jié)上。目前企業(yè)多采用木瓜蛋白酶酶解和人工結(jié)合的方法去除足表皮，但是這種方法消耗大量人力財(cái)力，效率極低。目前純粹用酶水解魷魚足去皮工藝的研究尚未見報(bào)道。

魷魚足去皮效果最直接有效的評價(jià)指標(biāo)即產(chǎn)品色澤，白而有光澤為最好。Lab顏色空間是當(dāng)前最常用的測定物體顏色的色空間之一［6］。該色空間由直角坐標(biāo)L＊、a＊、b＊構(gòu)成，其中L＊軸表示顏色明度，L＊＝0表示黑色，L＊＝100表示白色，即L＊值越高說明樣品越白［7］。 但在實(shí)際生產(chǎn)中，不能只考慮色澤指標(biāo)，還要兼顧肌肉組織質(zhì)構(gòu)和得率變化。本試驗(yàn)通過對比中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、動(dòng)物蛋白水解酶對魷魚足酶解去皮的效果，選擇去皮效果較好且宜于工業(yè)化生產(chǎn)的酶種，以L＊值結(jié)合感官評分為雙重指標(biāo)，采用單因素考察和響應(yīng)面分析優(yōu)化魷魚足去皮工藝，以達(dá)到充分利用魷魚資源，提高魷魚加工企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

秘魯魷魚足：舟山市越洋食品有限公司；

動(dòng)物蛋白水解酶（實(shí)測酶活力157 873U／g），中性蛋白酶（實(shí)測酶活力173 418U／g），木瓜蛋白酶（實(shí)測酶活力743 365U／g），堿性蛋白酶（實(shí)測酶活力187 417U／g）：廣西南寧龐博生物工程有限公司；

硫酸銅、甲醛、氫氧化鈉、鹽酸等：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH－6型，常州國華電器有限公司；

恒溫磁力攪拌器：5－2型，上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；

電子天平：FA1004A型，上海精天電子儀器有限公司；

pH值／溫度測量儀：Testo 230型，德圖儀器上海有限公司；

色差儀：Chroma Meter CR－400型，日本美能達(dá)公司；

質(zhì)構(gòu)儀：TMS－Pro型，美國 Food Technology Corporation公司；

便攜式色差儀：S560型，美國MicroOptix公司。

1.2 方法

1.2.1 原料預(yù)處理 將魷魚足流水解凍，選取粗細(xì)相同，表皮色澤相近的，清洗干凈，切成20cm左右的小段，備用。

1.2.2 蛋白酶活力的測定及篩選 根據(jù)文獻(xiàn)［8］測定酶活力并在料液比2∶10（m∶V）、加酶量0.30%的條件下，選用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶及動(dòng)物蛋白水解酶4種蛋白酶分別在各自最適作用條件［9］下對魷魚足進(jìn)行酶解去皮30min，以酶解去皮后L＊和感官評分為指標(biāo)進(jìn)行比較，選取最優(yōu)酶。

1.2.3 優(yōu)選酶酶解工藝的單因素試驗(yàn) 考慮到實(shí)際生產(chǎn)的便利性和優(yōu)選酶動(dòng)物蛋白水解酶作用特性，試驗(yàn)pH選7。以感官評分和色差中的L＊值為評價(jià)指標(biāo)，考察料液比、溫度、時(shí)間、加酶量對魷魚足酶解去皮效果的影響?；緱l件為溫度60℃、時(shí)間30min、加酶量0.20%，改變其中一個(gè)條件，其他條件不變，分別考察各因素影響水平。其中各因素水平梯度為料液比1∶10，2∶10，3∶10，4∶10，5∶10，6∶10（m∶V）；溫度45，50，55，60，65，70℃；加酶量0.05%，0.10%，0.15%，0.20%，0.25%，0.30%；時(shí)間10，20，30，40，50，60min。在單因素的基礎(chǔ)上，選取對去皮效果影響較大的因素作為考察變量，以產(chǎn)品感官評分和L＊值作為響應(yīng)值設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化酶解魷魚足去皮工藝。

1.2.4 色差的測定 使用美國 Microptix Corporation S560型色差儀測定樣品的L＊、a＊、b＊值。其中，L＊表示亮度，即樣品黑白度；＋a＊表示紅，－a＊表示綠；＋b＊表示黃，－b＊表示藍(lán)。

1.2.5 感官評定方法 由12人組成評定小組采用雙盲法［10－12］以肌肉色澤、皮肉脫離程度、組織硬度為感官評評定指標(biāo)對酶解產(chǎn)品進(jìn)行打分，評定之前需對評價(jià)員進(jìn)行培訓(xùn)，明確本試驗(yàn)的目的意義以及感官評定的指標(biāo)，評測過程中，各位評價(jià)員之間不允許討論交流。1.2.6 對照組與優(yōu)化組質(zhì)構(gòu)和顏色的對比驗(yàn)證 將未經(jīng)處理的對照組和試驗(yàn)最終優(yōu)化得到的樣品切成20mm×20mm×20mm的方塊，使用TMS－Pro型質(zhì)構(gòu)儀對樣品進(jìn)行TPA試驗(yàn)，采用P／5柱形探頭，測試速度為60mm／min，應(yīng)變量為50%［13］，觸發(fā)力為0.2N，每組平均測定10次。

表1 感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 The criteria of sensory evaluation

使用便攜式色差儀對對照組和優(yōu)化組魷魚足肌肉直接進(jìn)行顏色（RGB）測定。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)用 Microsoft Excel 2007進(jìn)行分析，測定數(shù)據(jù)每組至少采用9個(gè)平行。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)用 Design－expert 8.0.6軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

酶的種類對L＊值和感官評分的影響見表2。由表2可知，不同酶水解魷魚足去皮效果有明顯的不同，其中動(dòng)物蛋白水解酶效果最好，其次為中性蛋白酶、木瓜蛋白酶，堿性蛋白酶的效果最差。這可能是由于動(dòng)物蛋白水解酶主要由蛋白內(nèi)切酶、外切酶和風(fēng)味酶等組成，可通過內(nèi)切酶從中間切斷蛋白內(nèi)部的肽鏈和外切酶從多肽鏈的末端切斷釋放氨基酸，從而使酶作用效果更好。根據(jù)比較結(jié)果，試驗(yàn)選取動(dòng)物蛋白水解酶作為魷魚足去皮工藝的優(yōu)選酶。

2.2 優(yōu)選酶酶解工藝的單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 料液比對酶解去皮效果的影響 圖1是不同料液比下的樣品L＊值和感官評分結(jié)果。由圖1可知，當(dāng)料液比在1∶10～2∶10（m∶V）時(shí)，L＊值和感官評分隨料液比的增加而迅速增長，當(dāng)料液比大于2∶10（m∶V）時(shí)，感官評分逐漸減小，L＊值變化不明顯，可能是因?yàn)閱挝幻娣e的物料結(jié)合的酶量已經(jīng)過飽和而抑制了酶解反應(yīng)速率。影響酶解效果的因素有料液比、加酶量、溫度、時(shí)間、pH等，但是在工廠實(shí)際生產(chǎn)中，料液比極難控制在特定數(shù)值上，而且參考徐錦等［14］和馬小燕等［15］在動(dòng)物蛋白水解酶水解肉類產(chǎn)品的研究中料液比均為2∶10（m∶V），故本試驗(yàn)料液比確定為2∶10（m∶V）而不再做進(jìn)一步的響應(yīng)面優(yōu)化分析。

表2 酶的種類對L＊值和感官評分的影響Table 2 Effect of enzyme on the L＊ value and sensory evaluation value

2.2.2 溫度對酶解去皮效果的影響 酶類為活細(xì)胞產(chǎn)生的具有生物催化功能的有機(jī)物質(zhì)有自己的最適反應(yīng)溫度，在此溫度時(shí)，酶具有最高的催化效率，但高于最適溫度后，酶的催化能力會(huì)迅速下降。由圖2可知，L＊值隨溫度升高而一直增大，說明魷魚足的顏色一直在變白。感官評分隨著酶解溫度升高亦顯著增加，并于60℃時(shí)感官評分達(dá)到最大值。但是雖然在大于60℃時(shí)，酶的催化能力有所下降，但是不明顯，可能是由于所選溫度范圍尚未達(dá)到動(dòng)物蛋白水解酶大量失活所需溫度。從試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出酶解最適溫度為60℃，這與劉小玲等［16］和危貴茂等［17］研究的動(dòng)物蛋白水解酶作用最適溫度一致。

2.2.3 加酶量對酶解去皮效果的影響 感官評分和L＊值隨加酶量的變化結(jié)果見圖3。由圖3可知，當(dāng)加酶量從0.05%增加到0.20%時(shí)，L＊值和感官評分隨之增加，但添加量大于0.20%后，兩者趨于平緩，幾乎沒有變化。理論上酶加量越大，酶對魷魚足的水解程度就越深，酶除了水解表皮蛋白還會(huì)水解肌肉蛋白，這樣感官評分就會(huì)降低。但是該單因素試驗(yàn)中感官評分最終趨于平緩而未有明顯下降，這可能是因?yàn)樵囼?yàn)設(shè)計(jì)的時(shí)間較短，使魷魚足肌肉蛋白未受到酶的水解作用。經(jīng)分析本試驗(yàn)最適加酶量定為0.20%。

圖1 L＊值和感官評分隨料液比變化曲線Figure 1 Effect of material／liquid ratio on the L＊value and sensory evaluation value

圖2 L＊值和感官評分隨溫度變化曲線Figure 2 Effect of reaction temperature on the L＊value and sensory evaluation value

圖3 L＊值和感官評分隨加酶量變化曲線Figure 3 Effect of enzyme dosage on the L＊value and sensory evaluation value

2.2.4 水解時(shí)間對酶解去皮效果的影響 樣品在酶解液中浸泡時(shí)間越長，魷魚足質(zhì)地受到的影響也就越大。由圖4可知，隨著酶解溫度的延長，酶解去皮效果明顯提高，尤其L＊值一直在增大。但是當(dāng)時(shí)間大于40min后，感官評分隨著時(shí)間的延長而減小，這是由于隨著酶解時(shí)間的延長，魷魚足變軟，失去彈性，直接影響到產(chǎn)品的感官質(zhì)量。因此，本試驗(yàn)選取40min作為最適酶解時(shí)間。

圖4 L＊值和感官評分隨時(shí)間變化曲線Figure 4 Effect of reaction time on the L＊ value and sensory evaluation value

2.3 優(yōu)選酶酶解魷魚足去皮工藝響應(yīng)面優(yōu)化分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對酶解效果影響較大的加酶量、溫度、時(shí)間作為考察變量，L＊值（Y1）、感官評分（Y2）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)得到三因素三水平的二次回歸方程，擬合自變量和兩個(gè)因變量之間的函數(shù)關(guān)系，利用響應(yīng)曲面分析法優(yōu)化魷魚足酶法去皮工藝。試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平見表3。

表3 魷魚足酶解去皮響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素和水平Table 3 Factors and levels in the response surface design

以L＊值（Y1）、感官評分（Y2）為響應(yīng)值，按照“1.2.3”Box－Benhnken設(shè)計(jì)進(jìn)行的試驗(yàn)結(jié)果見表4。通過Design－expert 8.0.6軟件對響應(yīng)值與各因素的編碼值進(jìn)行回歸擬合后，得到回歸式：

表4 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Response surface design layout and experimental results

對二次回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表5和表6。由表5可知，以L＊值為響應(yīng)值建立的回歸模型具有較高的顯著性（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（P＝0.213 0＞0.05），模型相關(guān)系數(shù)R2＝97.54%，修正相關(guān)系數(shù)R2Adj＝95.33%；由表6可知，以感官評分為指標(biāo)建立的回歸模型亦具有很高的顯著性（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（P＝0.117 9＞0.05），模型的相關(guān)系數(shù)R2＝98.84%，修正相關(guān)系數(shù)R2Adj＝97.80%，說明模型的擬合程度好，試驗(yàn)誤差小，可用來分析和預(yù)測魷魚足酶法去皮的工藝效果［18－20］。由模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可知，模型的一次項(xiàng)A、B、C對L＊值和感官評分的線性效應(yīng)極顯著，二次項(xiàng) A2、B2對工藝的曲面效應(yīng)極顯著，但是3個(gè)因素的交互作用效果不顯著。表明各因素對魷魚足酶法去皮工藝的影響不是簡單的線性關(guān)系。從各變量顯著性檢驗(yàn)P值的大小，可以看出酶解溫度和酶添加量對魷魚足酶解去皮工藝的影響大于酶解時(shí)間對其的影響。

2.4 優(yōu)選酶酶解魷魚足去皮工藝的優(yōu)化組合

設(shè)定3因素的取值范圍：加酶量0.15%～0.25%、酶解溫度55～65℃、時(shí)間30～50min，并將L＊值、感官評分設(shè)定為最大值，Design－expert 8.0.6軟件給出的最優(yōu)工藝參數(shù)為酶添加量0.25%、溫度61.54℃、時(shí)間45min，其理論L＊值為89.93，感官評分值為98.22。考慮到實(shí)際工藝的成本和可行性，將酶解工藝參數(shù)修正為加酶量0.25%、溫度61℃、時(shí)間45min，根據(jù)修正后的最優(yōu)工藝進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，其L＊值為88.67，感官評分為97.32，此時(shí)感官效果為皮肉完全分離，色澤潔白明亮，肉質(zhì)與原料無差異。

2.5 對照組和優(yōu)化組質(zhì)構(gòu)（TPA）及顏色（RGB）對比驗(yàn)證

質(zhì)構(gòu)直接反映肉類的軟硬度和彈性，是肉類產(chǎn)品加工時(shí)必須考慮的指標(biāo)。在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，溫度過高或時(shí)間過長會(huì)使魷魚足肌肉變軟，彈性減小。由表7可知，優(yōu)化組和原料對照組在肌肉硬度、彈性、內(nèi)聚性等質(zhì)構(gòu)指標(biāo)上并無很大差異，也就說明該試驗(yàn)最終確定的酶法去皮處理方案對魷魚足質(zhì)地上沒有很大影響，這與感官評分結(jié)果相一致。

RGB色彩模式是通過對紅（R）、綠（G）、藍(lán)（B）3個(gè)顏色通道的變化以及它們相互之間的疊加來得到各式各樣的顏色的，幾乎包括了人類視力所能感知的所有顏色，是目前運(yùn)用最廣的顏色系統(tǒng)之一。試驗(yàn)中，色差儀直接測定對照組R、G、B值分別為54，50，57，優(yōu)化組分別為253，250，245。對照RGB配色表可以看出優(yōu)化組顏色為乳白色，這與試驗(yàn)優(yōu)化中和感官評定結(jié)果相一致。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過對動(dòng)物蛋白水解酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶酶解魷魚足去皮效果的比較，確定動(dòng)物蛋白水解酶為工藝優(yōu)選酶，并參照單因素試驗(yàn)選取酶添加量、酶解溫度、時(shí)間三因素進(jìn)行中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，優(yōu)化動(dòng)物蛋白水解酶酶解魷魚足去皮的工藝。試驗(yàn)顯示加酶量、酶解溫度、時(shí)間及其3個(gè)因素的二次項(xiàng)對酶解效果有極其顯著的影響，最終確定出動(dòng)物蛋白水解酶酶解魷魚足去皮工藝最佳參數(shù)為料液比2∶10（m∶V）、加酶量0.25%、酶解溫度61℃、酶解時(shí)間45min，并經(jīng)過感官評分、L＊值、質(zhì)構(gòu)及RGB驗(yàn)證，在此條件下酶解去皮后魷魚足效果明顯，可直接用于企業(yè)生產(chǎn)環(huán)節(jié)，具有實(shí)際應(yīng)用意義。

表5 試驗(yàn)中酶因子對L＊值效果影響的方差分析?Table 5 Analysis of variance in the experimental effect of enzyme factors on the L＊ value

表6 試驗(yàn)中酶因子對感官評分效果影響的方差分析?Table 6 Analysis of variance in the experimental effect of enzyme factors on the sensory evaluation value

表7 對照組和優(yōu)化組質(zhì)構(gòu)特性比較Table 7 The texture difference compared control group with optimized group

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