乳腺癌組織中Survivin、Ki67的表達變化及意義

魏曉麗，張 玉，劉敏麗，景彩萍，成延萍

(1延安大學醫(yī)學院病理學教研室，陜西 延安 716000;2延安市人民醫(yī)院)

生存素(Survivin)是新發(fā)現的凋亡抑制蛋白(IAP)基因家族的新成員，在人類大多數腫瘤組織中豐富表達，其抗凋亡作用可通過Caspase途徑和非Caspase途徑實現。細胞核增殖抗原(Ki67)是一種與增殖細胞相關的核抗原，是近年來認為能更好評估腫瘤細胞增殖活性的重要標志物［1，2］。本研究采用免疫組化法對乳腺癌組織中Survivin、Ki67進行檢測，觀察其表達變化并探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇延安大學醫(yī)學院附屬教學醫(yī)院病理科2004年1月～2007年1月手術切除的乳腺癌組織標本82例份作為研究對象(腫瘤組)，患者均為女性，年齡30～67歲，平均46.2歲。所有患者術前均未經放療、化療、免疫治療等抗腫瘤治療且均經過病理證實。月經狀況:絕經前44例，絕經后38例;腫瘤直徑:＜2 cm 21例，2～5 cm 47例，＞5 cm 14例;病理學類型:浸潤性導管癌73例，浸潤性小葉癌6例，其他類型癌3例;組織學分級:Ⅰ級21例，Ⅱ級42例，Ⅲ級19例;TNM分期:Ⅰ～Ⅱ期58例，Ⅲ～Ⅳ期24例;淋巴結轉移:無35例，有47例;ER:陰性39例，陽性43例;PR:陰性42例，陽性40例。另選同期乳腺增生性病變組織20例份(增生組)，癌旁正常乳腺組織10例份(正常組)。各組一般資料無統(tǒng)計學差異，具有可比性。

1.2 Survivin、Ki67檢測方法 所有標本均采用10%甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)4～5 μm切片。采用免疫組化SP法。Survivin兔抗人多克隆抗體為Santa Cruz公司產品，Ki67/ER/PR鼠抗人單克隆抗體、免疫組化SP試劑盒均購自福州邁新生物技術開發(fā)公司。實驗主要步驟:石蠟包埋組織切片常規(guī)脫蠟至水，3%過氧化氫室溫15 min阻斷內源性過氧化酶，微波修復抗原95～98℃，15～20 min，滴加一抗(多抗Survivin、單抗Ki67/ER/PR工作液)4℃過夜，依次滴加生物素化二抗，辣根酶標記鏈霉菌卵白素工作液，DAB顯色，蘇木精復染，脫水至透明封片，顯微鏡觀察。用PBS代替一抗作陰性對照，用已知陽性片作陽性對照。結果判斷標準:Survivin染色陽性產物為黃色、棕黃色顆粒，定位于細胞質內。每例在400倍光鏡下觀察5個視野，計數1000個細胞，計算陽性細胞百分率，凡染色強度明顯高于背景者為陽性表達，將陽性細胞按其數量及染色強度分級:弱陽性(+)，陽性細胞百分率＜10%，顯色強度為淡黃或僅個別細胞呈黃至棕黃色;中度陽性(++)，陽性細胞百分率10% ～60%，顯色強度介于弱陽性與強陽性之間;強陽性(+++)，陽性細胞百分率60%以上，多數細胞呈黃至棕黃色;染色強度與背景無明顯差別者為陰性(－)。利用HMIA2000高清晰度彩色圖文分析系統(tǒng)，將陽性細胞的染色強度轉化為量化指標，測得其平均光密度(OD)值。Ki67/ER/PR染色陽性產物棕黃顆粒定位于細胞核內，增殖活性以Ki67標記指數(LI)代表，每例選10個高倍視野，每個視野計數100個細胞，共計數1000個細胞，計算Ki67陽性細胞所占百分比，即為LI。Ki67標記指數越大，反映處于增殖階段的細胞數量越多，細胞增殖越活躍。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件。計數資料比較采用t檢驗和χ2檢驗，相關性分析采用Spearman法。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組Survivin和Ki67的表達 見表1。

表1 各組Survivin和Ki67的表達()

表1 各組Survivin和Ki67的表達()

注:與正常組比較，*P ＜0.01;與增生組比較，△P ＜0.01

組別 n Survivin(OD值) Ki67(LI)腫瘤組 82 0.517±0.047＊△ 23.85±11.46＊△增生組 20 0.327 ±0.054* 10.48 ± 5.19*正常組10 0.039 ±0.026 3.51 ± 2.64

2.2 相關性分析 乳腺癌組織中Survivin表達與Ki67 表達呈正相關(r=6.821，P ＜0.05)，提示 Survivin陽性表達的乳腺癌中癌細胞增殖活性明顯增加。

2.3 Survivin表達與乳腺癌臨床病理參數的關系見表2。Survivin表達與乳腺癌TNM分期及淋巴結轉移相關(P均＜0.05)，而與月經狀況、腫瘤直徑、病理學類型、組組學分級、ER、PR無相關性(P均＞0.05)。詳見表 2。

表2 Survivin表達與乳腺癌臨床病理參數的關系

2.4 Survivin表達與乳腺癌預后的關系 Survivin陽性及陰性表達患者5年生存率分別為63.9%(39/61)、90.5%(19/21)，兩者比較，P ＜0.05。

3 討論

乳腺癌的發(fā)生與其他惡性腫瘤一樣，是一個多基因參與并經過多步驟的復雜過程，其中細胞增殖和凋亡平衡失調是導致腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要因素［3］。正常細胞的增殖、分化和凋亡處于平衡狀態(tài)，凋亡抑制有利于細胞的增殖，并有利于異?；虻倪M一步積聚，促使細胞惡性轉化，從而有助于腫瘤的發(fā)生進展。Survivin作為IAP家族中目前發(fā)現的惟一同時參與細胞凋亡與周期調控的分子，對維持細胞快速增殖及腫瘤細胞的生理功能具有非常重要的作用。Survivin參與細胞的生長和分化，其分布具有明顯的組織差異性，在胚胎發(fā)育過程中表達，在正常分化成熟的組織中不表達，而在腫瘤組織中又重新表達，因此與腫瘤的發(fā)生密切相關［4］。本研究顯示，與正常組比較，增生組及腫瘤組Survivin OD值明顯升高，提示Survivin的表達發(fā)生在乳腺癌惡性轉化的早期，在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，Survivin在乳腺癌中的高表達，有望成為乳腺癌基因治療的靶點。本研究還發(fā)現，Survivin表達與乳腺癌絕經情況、腫瘤直徑、病理學類型、組織學分級、ER、PR狀態(tài)無相關性，而與TNM分期、淋巴結轉移有相關性。說明正常細胞脫離原組織時即啟動凋亡程序，不會形成遠隔部位的增殖，而癌細胞由于Survivin對凋亡的抑制，細胞得以繼續(xù)分裂，造成腫瘤鄰近和遠隔部位轉移灶的形成。因此，我們推斷乳腺癌中Survivin陽性患者有較高的惡性度，更具有侵襲性，對乳腺癌細胞的轉移起促進作用，Survivin在乳腺癌組織中高表達與其生物學特性密切有關，可作為判斷乳腺癌發(fā)生、發(fā)展、轉移等生物學行為的一個指標。本研究Survivin陽性表達患者5年生存率明顯低于陰性表達患者，此與國內外等報道相近［5，6］。說明 Survivin陰性表達者生存時間高于陽性者，提示Survivin陽性表達的乳腺癌患者預后不良。

Ki67是與細胞增殖相關的核抗原，只在增殖細胞G1、S、G2和M期表達，Ki67抗體是正對處于增殖周期的人類細胞核抗原的抗體，因其半衰期短，細胞脫離增殖周期后迅速降解，檢測結果的可靠性優(yōu)于半衰期長的增殖細胞核抗原，因此被視為較可靠的全面反映細胞群體增殖活性的指標［7，8］。本研究顯示，與正常組比較，增生組及腫瘤組Ki67 LI明顯升高，表明在乳腺癌和乳腺增生性病變組織中存在異常活躍的細胞群體增殖，腫瘤的高增殖又與腫瘤浸潤生長和轉移有關，因此Ki67的高表達與腫瘤患者的預后不良相關［9］。本文還發(fā)現，Survivin表達與Ki67表達呈正相關，提示Survivin不僅參與凋亡的調控，還可能促進了細胞增殖，從而通過抑制細胞凋亡和促進細胞增殖的雙重作用來促進腫瘤的進展［10］。

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