胃癌組織中 c-FLIP、NF-κB p65 的表達變化及意義

陳 軍，覃思繁，林思彤，韋常宏

(廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院，南寧 530021)

目前，胃癌的發(fā)生機制尚未闡明，其侵襲和轉移的分子調控機制研究是分子生物學研究的熱點問題之一。其中，F(xiàn)as介導的凋亡抑制在乳腺癌細胞的生長過程中有重要的作用。細胞型Fas相關的死亡區(qū)域蛋白樣白介素-1轉換酶抑制蛋白(c-FLIP)被認為是一種重要的細胞凋亡抑制蛋白。細胞核因子kappa B(NF-κB)是一種廣泛存在的轉錄因子，在多種腫瘤組織內呈活化狀態(tài)，在腫瘤細胞生長、增殖及浸潤轉移等方面發(fā)揮重要的作用。近年來，我們采用免疫組化法檢測胃癌組織中的c-FLIP和NF-κB p65，觀察其表達變化，旨在探討兩者在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2004年1月～2006年6月本院收治的胃癌患者80例，男48例，女32例;年齡25～68(40.1±13.2)歲?；颊咝g前均未行任何治療。手術留取胃癌組織標本80份(胃癌組)，所有標本均經(jīng)病理證實。臨床分期Ⅰ、Ⅱ期36例，Ⅲ期44例;腫瘤直徑≥3 cm 52例，＜3 cm 28例;浸潤至黏膜及肌層44例，漿膜及漿膜外36例;組織學類型為管狀腺癌34例，乳頭狀腺癌20例，黏液腺癌14例，印戒細胞癌12例;分化程度為高、中分化50例，低分化30例;淋巴結轉移35例，術后復發(fā)29例。留取同組病例的癌旁組織(均距腫瘤邊緣5 cm)80份(癌旁組)作為對照。

1.2 試劑 c-FLIP濃縮型兔抗人多克隆抗體(美國Neomarkers公司)，抗體稀釋濃度為1∶100。NF-κB p65濃縮型鼠抗人單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，抗體稀釋濃度為1∶100。即用型快捷MaxvisionTM檢測試劑盒(福州邁新生物技術科技公司)。

1.3 c-FLIP、NF-κB p65 的檢測 采用免疫組化Envision兩步法。整個過程按試劑盒說明書進行。每批染色均設已知陽性切片作陽性對照，用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對照。結果判斷標準:c-FLIP表達產(chǎn)物主要定位于細胞質，呈棕黃色顆粒為陽性細胞(見圖1)。NF-κB p65的陽性表達以細胞核和細胞質出現(xiàn)棕褐色顆粒為準(見圖2)。由兩位醫(yī)師采用雙盲法觀察每張切片。陽性判斷根據(jù)染色程度和免疫陽性細胞占腫瘤細胞總數(shù)百分比綜合記分。按切片中癌細胞染色強度計分:0分細胞無顯色，1分呈淡黃色，2分呈棕黃色，3分呈棕褐色(染色深淺需與背景著色相對比);再按切片中陽性癌細胞數(shù)所占百分比打分:0分為陰性，1分為陽性癌細胞≤10%，2分為11% ～50%，3分為50% ～75%，4分為75%以上。染色強度與陽性細胞百分比的乘積＞3分計為陽性。

圖1 c-FLIP在胃癌中表達陽性(Envision兩步法，100×)

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)比較用χ2檢驗，相關性分析用Spearman相關分析法。檢驗水準α=0.05。

圖2 NF-κB p65在胃癌中表達陽性(Envision兩步法，100×)

2 結果

2.1 c-FLIP、NF-κB p65的表達 胃癌組、癌旁組c-FLIP 陽性率分別為 67.50%(54/80)、45.00%(36/80)，NF-κB p65 陽性率分別為 70.00(56/80)、51.25%(41/80)，P 均 ＜0.05。

2.2 c-FLIP、NF-κB p65 的表達與胃癌臨床病理特征的關系 見表1。由表1可知，c-FLIP的表達與胃癌臨床分期、分化程度、淋巴結轉移、術后復發(fā)相關(χ2值分別為 0.039、0.019、0.035、0.028，P 均 ＜0.05)，NF-κB p65 的表達與胃癌浸潤深度、分化程度、淋巴結轉移相關(χ2值分別為 0.019、0.012、0.001，P 均 ＜0.05)。

表1 c-FLIP、NF-κB p65表達與胃癌臨床病理特征的關系

2.3 相關性分析 Spearman相關分析示，c-FLIP和NF-κB p65在胃癌組織中表達呈正相關(r=0.303，P=0.006)。

3 討論

細胞凋亡是一種由基因控制的自主性有序死亡，是生理性細胞死亡過程，對保持正常生長及自身穩(wěn)定有十分重要意義。腫瘤細胞通過影響內源性及外源性的機制來逃避凋亡。c-FLIP是Fas/FasL細胞凋亡信號傳導途徑的抑制蛋白，在腫瘤壞死因子受體超家族的死亡受體抑制中扮演重要角色。FLIP的死亡效應結構域與FAD和Caspase-8結合，競爭性抑制Caspase-8結合到死亡誘導復合體上，從而阻斷了Fas介導的凋亡信號的傳導［1］。研究表明，c-FLIP具有雙重功能，F(xiàn)asL和c-FLIP的濃度對信號的傳導具有決定性作用，高濃度存在于細胞中時會抑制Fas介導的凋亡;相反，在低濃度或生理情況下，則發(fā)揮促凋亡作用［1，2］。故推測 c-FLIP 過量表達在腫瘤發(fā)生中起重要作用。Ryu等［3］檢測了52例大腸腺癌組織，其陽性表達率為78.8%，顯著高于大腸息肉和癌旁正常組織。本研究胃癌組c-FLIP陽性率明顯高于癌旁組，提示胃癌組織中c-FLIP蛋白表達水平增高，抑制腫瘤細胞的凋亡，從而促進了腫瘤的發(fā)生及進展。本研究還發(fā)現(xiàn)，c-FLIP的高表達與胃癌臨床分期、分化程度、淋巴結轉移及術后復發(fā)相關，提示其在胃癌的發(fā)展過程中亦起著十分重要的作用。

NF-κB是1986年Sen和Baltimore首先從B淋巴細胞核抽提物中檢出的，其是可與免疫球蛋白的輕鏈基因增強子κB序列特異結合的核蛋白因子，最常見的是以p50/p65異二聚體形式存在于細胞質中。當NF-κB結合位點接受多種免疫刺激，如腫瘤壞死因子、IL-1、脂多糖等激活蛋白激酶，致使NF-κB的抑制物IκB磷酸化而解離，NF-κB二聚體被激活進入細胞核，從而激活基因表達［4］。在腫瘤發(fā)生的實驗研究中，NF-κB的組成型激活與致瘤性轉化有關［5］。研究發(fā)現(xiàn)，在多種惡性腫瘤均有NF-κB的激活，NF-κB可能通過調控與細胞生長增殖、抗凋亡、血管生成和轉移的相關基因表達有關，促進了惡性腫瘤的發(fā)展［6］。本研究胃癌組NF-κB陽性率明顯高于癌旁組，且表達與胃癌浸潤深度、分化程度、淋巴結轉移、術后復發(fā)相關，雖與Biswas等［7］研究結果不盡相同，但亦提示其在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮著重要的作用，對胃癌的預后與治療有一定的指導意義。

從理論上分析，c-FLIP基因編碼序列中存在κB位點，故腫瘤細胞中高表達活化的NF-κB蛋白可以上調FLIP的轉錄表達，使腫瘤細胞免于Fas、TRAIL介導的凋亡信號的調控［8］。Kataoka 等［9］發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LIP誘導NF-κB激活能被負相TRAF2顯著抑制，并且內源性TRAF2特異的與FLIP相互作用，形成FLIPCaspase-8-TRAF2三聚復合體結構為誘導NF-κB激活所必需。另有許多文獻報道，抑制腫瘤細胞的NF-κB活性可提高TRAIL的促凋亡作用，并有 c-FLIP的表達下降，提示NF-κB通路可能通過FLIP來抑制 TRAIL的促凋亡作用［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，c-FLIP和NF-κB p65在胃癌中表達呈正相關，提示兩者在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起著協(xié)同作用。

總之，c-FLIP、NF-κB p65 高表達在胃癌的發(fā)生及發(fā)展中起重要作用，兩者可能是胃癌細胞凋亡信號傳導網(wǎng)絡中重要的一環(huán)，但其具體作用機制尚待進一步研究闡明。聯(lián)合檢測兩者在胃癌中的表達情況對胃癌診斷、病情進展的評估及預后判斷有重要意義，并可為胃癌的基因靶向治療提供了新的途徑。

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