雙液相體系強化氧傳遞促進(jìn)微生物油脂生產(chǎn)

顏日明，艾佐佐,3，汪涯，張志斌，曾慶桂，朱篤,

1 江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 江西省亞熱帶植物資源保護(hù)與利用重點實驗室，江西 南昌 3300222 江西科技師范大學(xué)，江西 南昌 3300133 江西教育學(xué)院理學(xué)院，江西 南昌 330032

雙液相體系強化氧傳遞促進(jìn)微生物油脂生產(chǎn)

顏日明1，艾佐佐1,3，汪涯2，張志斌1，曾慶桂1，朱篤1,2

1 江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 江西省亞熱帶植物資源保護(hù)與利用重點實驗室，江西 南昌 330022
2 江西科技師范大學(xué)，江西 南昌 330013
3 江西教育學(xué)院理學(xué)院，江西 南昌 330032

顏日明, 艾佐佐, 汪涯, 等. 雙液相體系強化氧傳遞促進(jìn)微生物油脂生產(chǎn). 生物工程學(xué)報, 2013, 29(4): 536?539.

Yan RM, Ai ZZ, Wang Y, et al. Improved production of microbial lipids in the two-liquid phase fermentation system. Chin J Biotech, 2013, 29(4): 536?539.

文中通過添加氧載體正十二烷進(jìn)行雙液相發(fā)酵來提高發(fā)酵性絲孢酵母利用木薯淀粉水解液生產(chǎn)微生物油脂的產(chǎn)量。結(jié)果表明，在搖瓶發(fā)酵液中添加氧載體，能明顯緩解發(fā)酵過程中的氧限制程度。在2 L發(fā)酵罐中添加1%正十二烷進(jìn)行雙液相高密度發(fā)酵，其發(fā)酵生物量和油脂產(chǎn)量分別達(dá)到101.2 g/L和50.28 g/L。氣相色譜分析表明，添加了氧載體發(fā)酵的微生物油脂中含有更高的飽和脂肪酸含量。

正十二烷，氧載體，雙液相發(fā)酵，微生物油脂，發(fā)酵性絲孢酵母

近年來，微生物的油脂發(fā)酵生產(chǎn)正成為發(fā)展生物柴油產(chǎn)業(yè)和生物經(jīng)濟(jì)的重要方向[1]。木薯作為非糧作物，具有適應(yīng)性強、生長快、產(chǎn)量大，可生長于山野荒地，不與糧食爭地等優(yōu)點[2]，成為發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂的良好候選原料。我們在前期已經(jīng)對利用木薯淀粉水解液發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂工藝進(jìn)行了一些有益的探索，并獲得了一些結(jié)果[3-5]。然而，在發(fā)酵過程中我們發(fā)現(xiàn)以木薯淀粉作為原料，存在發(fā)酵液粘度較大等問題，導(dǎo)致發(fā)酵過程中氧傳遞受限，氧供應(yīng)的不足使得發(fā)酵過程中菌體的生長和油脂的合成受到明顯的影響。

利用氧載體 (Oxygen-vector) 提高發(fā)酵過程中的氧傳遞效率是一種目前應(yīng)用較廣泛的方法。劉紅等[6]發(fā)現(xiàn)5%正十二烷的添加量可使發(fā)酵液最終L-天冬酰胺酶酶活提高21%左右；梁新樂等[7]使用豆油作為氧載體可以促進(jìn)法夫酵母蝦青素的合成；Narta等[8]使用 6%液體石蠟使得 L-天冬酰胺酶活性提高了 34%，生物量提高了 48%。國內(nèi)外一些研究表明，不同的發(fā)酵產(chǎn)品，其氧載體種類也不盡相同。優(yōu)良的氧載體能與發(fā)酵液形成的雙液相發(fā)酵體系，可以大大改善氧氣傳遞，提高發(fā)酵液中氧氣的溶解度，從而提高好氧發(fā)酵的產(chǎn)率[9-13]。

本文以木薯淀粉水解液為碳源，通過添加正十二烷對發(fā)酵性絲孢酵母Trichosporon fermentans的生長和油脂積累情況進(jìn)行了研究，以探索正十二烷作為氧載體在提高微生物生產(chǎn)油脂產(chǎn)量中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 木薯淀粉

木薯淀粉購自廣西武鳴縣恒星淀粉廠。

1.1.2 發(fā)酵菌種

發(fā)酵性絲孢酵母T. fermentansF12菌株經(jīng)本實驗室誘變獲得，原始菌株購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心 (保藏編號：CICC1368)。

1.1.3 培養(yǎng)基

方法參照文獻(xiàn)[4]。

1.2 方法

1.2.1 木薯淀粉水解液的制備

方法參照文獻(xiàn)[5]。

1.2.2 生物量的測定

方法參照文獻(xiàn)[4]。

1.2.3 培養(yǎng)基氧傳遞系數(shù) (KLa) 的測定

KLa的測定采用 PS6700型發(fā)酵尾氣分析儀(重慶川儀分析儀器有限公司) 在線測定。

1.2.4 微生物油脂的提取

采用索氏提取法[14]。

1.2.5 培養(yǎng)條件

搖瓶培養(yǎng)：方法參照文獻(xiàn)[4]。

發(fā)酵罐分批補料培養(yǎng)：采用2 L發(fā)酵罐 (德國B. Braun)，初始裝液量為1.2 L，5%的接種量，當(dāng)殘?zhí)菨舛鹊陀?0 g/L時，開始補加濃度為600 g/L的木薯淀粉水解液。培養(yǎng)溫度為28 ℃，通氣量1 vvm，發(fā)酵過程中用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH不低于6.0。

1.2.6 脂肪酸成分測定

方法參照文獻(xiàn)[4]。

2 結(jié)果與分析

2.1 正十二烷濃度對發(fā)酵的影響

我們前期分別考察添加大豆油、油酸、正己烷和正十二烷等氧載體對T.fermentans的菌體生長和油脂產(chǎn)量的影響，結(jié)果表明正十二烷具有較好的促進(jìn)作用。為了進(jìn)一步考察不同濃度的正十二烷對菌體生長和油脂產(chǎn)量的影響，我們在搖瓶發(fā)酵液中分別添加0.5%、1%、2%和4% (V/V) 的正十二烷，結(jié)果表明，1%的正十二烷添加量有利于細(xì)胞的油脂積累，最高油脂含量為61.93%。

2.2 正十二烷在搖瓶發(fā)酵中的作用

為了研究氧載體在微生物油脂中的作用，我們通過改變250 mL搖瓶的裝液量和轉(zhuǎn)速條件來研究正十二烷在T. fermentans發(fā)酵中的作用。結(jié)果表明，隨著裝液量的提高，氧氣供應(yīng)限制程度增加，發(fā)酵生物量和油脂含量均明顯降低，但添加了1%正十二烷的搖瓶比對照的下降幅度要小。同樣，在低轉(zhuǎn)速的情況下，正十二烷的添加也可以明顯減緩因溶氧不足引起的菌體生長和油脂合成下降程度。這說明，在T. fermentans發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂過程中，氧氣的供應(yīng)水平會影響菌體生長和油脂產(chǎn)量。而添加正十二烷，可以促進(jìn)氧傳遞效率，從而有效地緩解氧限制條件下的溶氧不足。

2.3 2 L發(fā)酵罐中正十二烷對發(fā)酵的影響

我們考察了T. fermentans在2 L發(fā)酵罐上進(jìn)行補料分批高密度發(fā)酵，并對過程中 1%正十二烷添加前后的菌體生長、油脂積累情況進(jìn)行探索。結(jié)果表明，在發(fā)酵前期，隨著菌體的生長，發(fā)酵液中溶氧 (DO) 下降迅速，氧傳遞系數(shù) (KLa) 也伴隨著菌體濃度和發(fā)酵液粘度的增加而不斷下降。從28 h開始，通過不斷提高攪拌轉(zhuǎn)速，可以明顯提高KLa和DO的水平。但隨著菌體密度的上升，進(jìn)一步提高攪拌轉(zhuǎn)速 (52 h)，KLa和DO的增加有限，菌體生長速率和油脂合成速率也有所減緩。在不改變轉(zhuǎn)速的情況下，通過添加1%正十二烷 (66 h) 進(jìn)行雙液相發(fā)酵，KLa非常顯著地增加，比添加氧載體前平均增加了76%，并且此后一直保持在較高的水平（圖1A）。這表明，正十二烷的加入能與發(fā)酵液形成的雙液相體系，增大了氧傳遞的相面積，從而大大提高了氧的體積傳遞系數(shù)KLa，菌體生長速率和油脂合成速率明顯增加，在120 h時發(fā)酵生物量和油脂產(chǎn)量分別達(dá)到101.2 g/L和50.28 g/L，單細(xì)胞的油脂含量達(dá)到 49.68%，比未添加氧載體的對照批次分別提高了25.3%、41.8%和9.7%（圖1B）。這進(jìn)一步說明了添加氧載體后，氧的傳遞效率增加，從而有利于微生物的生長和油脂的合成。

2.4 添加正十二烷對油脂脂肪酸成分的影響

為了考察添加氧載體正十二烷對微生物油脂質(zhì)量的影響，我們對其成分進(jìn)行了氣相色譜分析(表 1)。結(jié)果表明，與對照組相比，添加正十二烷的微生物油脂中飽和脂肪酸的含量 (47.97%) 明顯要高于對照組 (38.92%)。這表明氧載體的添加會對細(xì)胞的脂肪酸生成產(chǎn)生一定的影響。

圖1 2 L發(fā)酵罐中添加正十二烷對發(fā)酵過程的影響Fig. 1 Effects of n-dodecane on T. fermentans fermentation in 2 L fermenter. (A) Experimental batch with adding 1% n-dodecane, the arrow in x-axis was the time point of adding n-dodecane. (B) Control batch.

3 討論

利用木薯淀粉水解液為基質(zhì)進(jìn)行微生物油脂發(fā)酵具有較好的應(yīng)用前景。然而，在發(fā)酵過程中普遍存在發(fā)酵液粘度大、氧傳遞效率低等缺點，導(dǎo)致發(fā)酵過程中生物量和油脂產(chǎn)量受限，無法滿足今后工業(yè)化生產(chǎn)要求。因此，有效解決發(fā)酵過程中的氧傳遞問題是實現(xiàn)利用木薯生產(chǎn)微生物油脂工業(yè)化的重要途徑之一。利用氧載體進(jìn)行雙液相發(fā)酵，可以大大提高氧的傳遞系數(shù)，有利于氧傳遞，對提高好氧發(fā)酵的經(jīng)濟(jì)效益具有重要意義。

表1 添加正十二烷對發(fā)酵性絲孢酵母油脂成分影響Table 1 Effects of n-dodecane on microbial lipids components produced from T. fermentans

本文將正十二烷作為氧載體應(yīng)用于發(fā)酵性絲孢酵母微生物油脂發(fā)酵的研究中，結(jié)果表明，正十二烷的添加能大大緩解T. fermentans發(fā)酵過程中氧限制的程度。在2 L發(fā)酵罐上添加1%正十二烷進(jìn)行高密度發(fā)酵，其生物量和油脂產(chǎn)量分別達(dá)到101.2 g/L和50.28 g/L，單細(xì)胞的油脂含量達(dá)到49.68%。

[1]Zhao ZB, Hu CM. Progress in bioenergy-oriented microbial lipid technology. Chin J Biotech, 2011, 27(3): 427–435 (in Chinese).

趙宗保, 胡翠敏. 能源微生物油脂技術(shù)進(jìn)展. 生物工程學(xué)報, 2011, 27(3): 427–435.

[2]Fang J, Pu WH, Zhang HJ. The development status of cassava industry at home and abroad. Chin Agric Sci Bull,2010, 26(16): 353–361 (in Chinese).

方佳, 濮文輝, 張慧堅. 國內(nèi)外木薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展近況. 中國農(nóng)學(xué)通報, 2010, 26(16): 353–361.

[3]Yuan JY, Ai ZZ, Zhu D, et al. Microbial oil production byTrichosporon cutaneumB3 using cassava starch. Chin J Biotech, 2011, 27(3): 453–460 (in Chinese).

袁錦云, 艾佐佐, 朱篤, 等. 皮狀絲孢酵母 B3利用木薯淀粉發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂. 生物工程學(xué)報, 2011, 27(3):453–460.

[4]Ai ZZ, Yan RM, Yuan JY, et al. Optimazation of single cell oil produced from cassava starch by response surface methodology. China Biotechnol, 2012, 32(7): 66–72 (in Chinese).

艾佐佐, 顏日明, 袁錦云, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化木薯淀粉發(fā)酵生產(chǎn)單細(xì)胞油脂工藝. 中國生物工程雜志, 2012, 32 (7):66–72.

[5]Zhang ZB, Yan RM, Zeng QG, et al. Study on hydrolysis process of cassava starch used for microbiol lipid fermentation.Food ferment ind, 2012, 38 (5): 86–90 (in Chinese).

張志斌, 顏日明, 曾慶桂, 等. 用于微生物油脂發(fā)酵的木薯淀粉水解工藝的優(yōu)化. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2012, 38(5):86–90.

[6]Liu H, Wei DZ. Effect of oxygen-vectors on L-asparaginase fermentation. Chin J Biotech, 1998, 14(3): 298–302 (in Chinese).

劉紅, 魏東芝. 氧載體對 L-天冬酰胺酶發(fā)酵過程影響的研究. 生物工程學(xué)報, 1998, 14(3): 298–302.

[7]Liang XY, Li JR, Chen M, et al. Application of oxygen vectors toPhaffia rhodozymacultivation for astaxanthin production. Mycosystema, 2003, 22(3): 424–429 (in Chinese).

梁新樂, 勵建榮, 陳敏, 等. 氧載體強化氧傳遞促進(jìn)法夫酵母蝦青素的合成. 菌物系統(tǒng)，2003, 22(3): 424–429.

[8]Narta U, Roy S, Kanwar SS, et al. Improved production of L-asparaginase byBacillus breviscultivated in the presence of oxygen-vectors. Bioresour Technol, 2011, 102(2):2083–2085.

[9]Wang JL. Enhancement of citric acid production byAspergillus Nigerusing n-dodecane as an oxygen-vector.Process Biochem, 2000, 35(10): 1079–1083.

[10]Amaral PFF, Freire MG, Marrucho IM, et al. Optimization of oxygen mass transfer in a multiphase bioreactor with perf l uorodecalin as a second liquid phase. Biotechnol Bioeng, 2008, 99(3): 588–598.

[11]Pu QK, Wang J, Lin GC. Enhancement of β-carotene production byBlakeslea trisporausing aqueous-organic two phase system. China Brew, 2011, 30(6): 54–57 (in Chinese).

蒲乾坤, 王婧, 林高超, 等. 利用水-有機兩相體系提高三孢布拉霉菌合成β-胡蘿卜素水平的研究. 中國釀造, 2011,30(6): 54–57.

[12]Peng C, Huang H, Liu X, et al. Influences of n-hexadecane onMortierella alpinegrowth and arachidonic acid production. Food Sci Technol, 2010, 35(5): 2–5 (in Chinese).

彭超, 黃和, 劉欣, 等. 添加正十六烷對高山被孢霉發(fā)酵生產(chǎn)花生四烯酸的影響. 食品科技，2010, 35(5): 2–5.

[13]Zhu Y, Yuan QP, Wang H. Enhancement of lycopene production byBlakeslea trisporausing oxygen-vectors and surface active agents. Microbiol China, 2006, 33(1): 90–93(in Chinese).

朱艷, 袁其朋, 王航. 添加氧載體及表面活性劑對番茄紅素發(fā)酵的影響. 微生物學(xué)通報, 2006, 33(1): 90–93.

[14]Li ZF, Zhang L, Shen XJ, et al. A Comparative study on four method of fungi lipid extraction. Microbiol China, 2001,28(6): 72–75 (in Chinese).

李植峰, 張玲, 沈曉京, 等. 四種真菌油脂提取方法的比較研究. 微生物學(xué)通報, 2001, 28(6): 72–75.

December 5, 2012; Accepted: January 28, 2013

Du Zhu. Tel: +86-791-88120193; E-mail: zhudu12@163.com

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃 (863計劃) (No. 2012AA021205)，江西省高等學(xué)?？萍悸涞赜媱潱魇≈饕獙W(xué)科學(xué)術(shù)與技術(shù)帶頭人培養(yǎng)計劃 (No. 060002) 資助。

Improved production of microbial lipids in the two-liquid phase fermentation system

Riming Yan1, Zuozuo Ai1,3, Ya Wang2, Zhibin Zhang1, Qinggui Zeng1, and Du Zhu1,2

1Key Laboratory of Protection and Utilization of Subtropic Plant Resources of Jiangxi Province,College of Life Sciences,Jiangxi Normal University,Nanchang330022,Jiangxi,China
2Jiangxi Science and Technology Normal University,Nanchang330013,Jiangxi,China
3School of Science,Jiangxi Institute of Education,Nanchang330032,Jiangxi,China

In the present study, we developed a two-liquid phase fermentation system by adding 1% n-dodecane as oxygen-vector to enhance the microbial lipids productivity ofTrichosporon fermentansusing cassava starch hydrolysate.Results suggest that the oxygen-vector could alleviate the oxygen shortage in flask fermentation. The cell mass and lipids concentration were 101.2 g/L and 50.28 respectively in 2 L fermenter with the presence of 1% n-dodecane. Additionally,gas chromatography analysis also reveals that the microbial lipids produced byT. fermentanscontained a higher percentage of saturated fatty acid in the oxygen-vector case.

n-dodecane, oxygen-vectors, two-liquid phase fermentation system, microbial lipids,Trichosporon fermentans

Supported by: National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2012AA021205), University Science and Technology Program of Jiangxi Province, Major Academic, Scientific and Technological Pacesetter Research Program of Jiangxi Province (No. 060002).

(本文責(zé)編 陳宏宇)