構(gòu)建定向T載體用于基因克隆和表達(dá)

鐘星，翟超，陳亮，余曉嵐，蔣思婧，嚴(yán)紅，楊登想，馬立新

1 湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430062

2 湖北省工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430062

3 湖北大學(xué)知行學(xué)院生物工程系，湖北 武漢 430011

隨著越來越多的物種基因組測(cè)序工作被完成，基因組數(shù)據(jù)庫收錄的基因組信息日益豐富，由已知序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增DNA并克隆，再進(jìn)行相關(guān)結(jié)構(gòu)、功能的研究，加快了生命科學(xué)研究的進(jìn)程[1-2]。聚合酶鏈反應(yīng) (PCR)是最強(qiáng)有力的基因克隆方法，為了直接克隆PCR產(chǎn)物，T載體被廣泛使用[3-5]。尤其當(dāng)面對(duì)大量的克隆工作時(shí)，使用T載體克隆PCR產(chǎn)物便成為最經(jīng)濟(jì)簡便的做法。傳統(tǒng)的 T載體克隆方法利用 LacZ alpha插入失活篩選插入事件[6]，但是由于 LacZ基因的移碼、載體自身發(fā)生異常重組等事件將導(dǎo)致產(chǎn)生一部分假陽性白色菌落，轉(zhuǎn)化后的白色菌落仍然需要被大量培養(yǎng)進(jìn)行質(zhì)粒抽提和鑒定[7-8]；利用傳統(tǒng)的T載體進(jìn)行克隆表達(dá)時(shí)，由于插入片段的方向具有隨機(jī)性，無法保證定向克隆，仍然需要篩選定向插入的克隆。

為了克服傳統(tǒng) T載體克隆方法需要大量鑒定重組子和無法保證定向克隆的缺點(diǎn)，我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè) LacZ正向篩選方案來實(shí)現(xiàn)免鑒定重組子、定向T載體克隆基因的方法。如圖1B所示，在非誘導(dǎo)條件下的Lac+的宿主菌中，Lac啟動(dòng)子下游LacO序列被LacO結(jié)合蛋白LacI所阻遏，LacZ基因的表達(dá)處于抑制狀態(tài)，該菌落在X-gal底物平板上顯示為白色；如果基于pBR322的高拷貝載體上含有 LacO序列，該載體將從 LacZ啟動(dòng)子單元上競(jìng)爭性吸附宿主菌內(nèi)源LacI蛋白，對(duì)宿主菌的乳糖啟動(dòng)子去抑制[9-10]，表達(dá)β-半乳糖苷酶并降解X-gal底物，使該菌落顯示為藍(lán)色(圖 1C)。pET-23a(+)是基于 pBR322改造的高拷貝載體。我們?cè)趐ET-23a(+)的基礎(chǔ)上構(gòu)建了定向T載體pETG，利用PCR片段和定向T載體連接重構(gòu)完整的LacO序列 (圖1A)，轉(zhuǎn)化Lac+菌株，使含有正確克隆的菌落變藍(lán)來指示定向插入的重組事件 (圖 1C)。對(duì)轉(zhuǎn)化后平板上的藍(lán)色菌落接種抽提質(zhì)粒后酶切和 PCR鑒定表明藍(lán)色菌落全部為定向插入的重組子。本研究利用構(gòu)建的定向T載體成功地克隆了103個(gè)人類肝蛋白編碼基因，隨機(jī)挑選其中 8個(gè)基因的克隆進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)，均獲得成功表達(dá)。對(duì)比傳統(tǒng)方法，利用該T載體進(jìn)行基因克隆非常簡單、高效、可靠，并且可以實(shí)現(xiàn)基因定向插入，實(shí)驗(yàn)過程無需鑒定重組子，避免了大量抽提質(zhì)粒和PCR鑒定的步驟，節(jié)約了大量的時(shí)間和試劑成本，同時(shí)該定向T載體還兼容傳統(tǒng)T載體基因克隆，該定向 T載體有大規(guī)模高通量的基因克隆和表達(dá)的應(yīng)用前景。

圖1 定向T載體克隆原理Fig. 1 Principle of a directional T vector cloning method. After ligation, the insert and vector will reconstituted a full length of ideal LacO(A); reconstituted full length of ideal LacO occurring on a high copy number plasmid pETG will titrate out of the lac repressors (LacI )which adhered to the LacO sites on F` plasmid, thus LacZ transcription is derepressed (B), and the colonies go blue (C). Followed by transformation, the recombinant events were phenotypically selected, transformants with blue color revealed the desired recombinants.

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

表達(dá)載體pET-23a(+)、用于表達(dá)的大腸桿菌BL21(DE3)購自Novagen公司，用于克隆的大腸桿菌XL10-Gold購自Stratagen公司，DH10β [基因型：mcrAΔ (mrr-hsdRMS-mcrBC)ф80lacZM15 ΔlacX74deoR recA1 araΔ 139 (ara，leu)7697 galU galK λ-rpsL nupG tonA umuc:: pir116 -frt F′ (Lac+pro+ΔoriT::Tc)]為哈佛醫(yī)學(xué)院 Stephen J Elledge教授所贈(zèng)送[10]，gfp模板質(zhì)粒pHBM2002為本實(shí)驗(yàn)室朱德武博士構(gòu)建[11]。

1.2 主要儀器和試劑

DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、SolutionⅠ連接試劑盒、LA Taq聚合酶和限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、XhoⅠ及StuⅠ購自TaKaRa公司；蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)和限制性內(nèi)切酶 BfuⅠ購于 Fermentas公司；質(zhì)粒抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，引物 (表 1)均在上海桑尼生物科技有限公司合成。所有的分子克隆操作都按照Sambrook等[12]提供的方法進(jìn)行。

1.3 方法

1.3.1 定點(diǎn)誘變消除pET-23a(+)上的BfuⅠ位點(diǎn)

根據(jù)pET-23a(+)載體序列設(shè)計(jì)兩對(duì)突變引物Mu23aF和Mu23aR、MublaF和MublaR，將載體上的兩個(gè) BfuⅠ酶切位點(diǎn)消除突變?yōu)?StuⅠ位點(diǎn)。PCR分別擴(kuò)增BfuⅠ酶切位點(diǎn)兩側(cè)的載體片段，瓊脂糖凝膠回收后共轉(zhuǎn)化XL10-Gold感受態(tài)細(xì)胞，通過體內(nèi)定點(diǎn)同源重組[11]，獲得重組中間載體 pET-23aM，送上海英駿生物公司測(cè)序。

1.3.2 構(gòu)建定向T載體pETG

設(shè)計(jì)一對(duì)引物在5￠端各引入pET-23aM同源臂和一個(gè)BfuⅠ位點(diǎn)，下游引物緊鄰BfuⅠ位點(diǎn)引入 13 bp的部分 LacO序列。用該引物從pHBM2002上擴(kuò)增得到Prrn-gfp表達(dá)盒片段。載體PET-23aM經(jīng)NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切后，瓊脂糖凝膠回收大片段。將回收的載體片段與prrn-gfp表達(dá)盒片段共轉(zhuǎn)化大腸桿菌 XL10-Gold感受態(tài)細(xì)胞，通過體內(nèi)定點(diǎn)同源重組，獲得定向T載體pETG，送上海英駿生物公司測(cè)序。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3.3 BfuⅠ酶切制備T載體

BfuⅠ酶切載體pETG，瓊脂糖凝膠回收完全酶切后的大片段，?20 ℃凍存。

1.3.4 PCR擴(kuò)增目的基因和T載體克隆

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫核苷酸序列查詢，選擇感興趣的基因 (如ATF5)，利用Genetool軟件設(shè)計(jì)一對(duì)引物，在所有的下游引物5￠端額外補(bǔ)加7 bp部分 LacO 序列 (5￠-CACAATT-3￠，如表 1 所示)。利用該引物和 LA Taq DNA聚合酶擴(kuò)增目的基因，并瓊脂糖凝膠回收目的片段。用連接酶試劑盒連接～60 ng PCR產(chǎn)物和～20 ng線性化定向T載體，連接反應(yīng)參見試劑盒說明。連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10β感受態(tài)細(xì)胞，涂布含有50 mg/mL氨芐西林鈉和 25 mg/mL X-gal的 LB平板。在37 ℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)10 h后，挑取藍(lán)色轉(zhuǎn)化子抽提質(zhì)粒。

1.3.5 蛋白質(zhì)表達(dá)和SDS-PAGE檢測(cè)

測(cè)序正確的克隆轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，蛋白質(zhì)表達(dá)和SDS-PAGE檢測(cè)方法參見分子克隆手冊(cè)[12]。

1.3.6 目的蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定

將目的蛋白質(zhì)條帶從SDS-PAGE膠上割下，按文獻(xiàn)[13]進(jìn)行膠內(nèi)消化與質(zhì)譜鑒定分析。

2 結(jié)果

2.1 定向T載體的構(gòu)建

以質(zhì)粒 pET-23a(+)為模板，引物 Mu23aF和Mu23aR、MublaF和MublaR分別擴(kuò)增獲得預(yù)期的～2.1 kb和～1.5 kb片段，瓊脂糖凝膠回收后共轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL10-GOLD感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組中間載體 pET-23aM。由于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是將兩個(gè)BfuⅠ位點(diǎn)消除并誘變成StuⅠ位點(diǎn)，StuⅠ酶切鑒定 pET-23aM 可以切出約 1.5 kb小片段，而pET-23aM經(jīng)BfuⅠ酶切無法切出小片段，該酶切鑒定結(jié)果表明pET-23a(+)上面的BfuⅠ酶切位點(diǎn)被成功誘變消除 (圖2)。

以質(zhì)粒 pHBM2002為模板，引物 GFPF和GFPR擴(kuò)增獲得預(yù)期的1 098 bp prrn-gfp表達(dá)盒片段，瓊脂糖凝膠回收后通過同源重組插入pET-23aM 中 NdeⅠ和 XhoⅠ位點(diǎn)，獲得定向 T載體pETG (圖3)。pETG經(jīng)BfuⅠ酶切得到約1 kb和3.6 kb的兩個(gè)片段 (圖4)，該結(jié)果表明gfp表達(dá)盒已成功插入載體pET-23aM中，兩個(gè) BfuⅠ酶切位點(diǎn)均被正確引入。

2.2 制備線性化定向T載體

超純質(zhì)粒抽提試劑盒抽提pETG質(zhì)粒，BfuⅠ完全酶切pETG后，瓊脂糖凝膠回收約3.6 kb的T載體片段 (圖4)，制備線性化定向T載體完成，該T載體可以用于下游連接反應(yīng)。

圖2 酶切鑒定pET23aMFig. 2 Identification of pET23aM by restriction enzyme digestion. M: DNA marker; 1: pET23aM; 2:pET-23a(+); 3: pET23aM digested with Stu I; 4:pET23aM digested with Bfu I; 5: pET-23a(+)digested with Stu I; 6: pET-23a(+)digested with Bfu I.

圖3 pETG載體圖譜及部分關(guān)鍵序列Fig. 3 A plasmid map of pETG and key sequences. (A) gfp expression cassette flanked by 6×his tag-Bfu I sites and Bfu I sites-13/20 LacO sequence was inserted into Nde I-Xho I site of pET-23aM. (B) The key sequence of pETG was indicated. (C)Bfu I restriction site and a full length of LacO sequence were showed, N stands for any base.

2.3 連接轉(zhuǎn)化和分析重組率

PCR擴(kuò)增的基因片段連接線性化定向 T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10β，從轉(zhuǎn)化平板 (圖1)上隨機(jī)挑取 10個(gè)藍(lán)色單菌落, 抽提質(zhì)粒并進(jìn)行酶切和PCR鑒定分析重組率。由于T載體末端設(shè)計(jì)有NdeⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)，可以利用該酶將插入片段ATF5 (849 bp)切除下來，質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果顯示從隨機(jī)挑取的 10個(gè)藍(lán)色的單菌落抽提出來的質(zhì)粒都切出目的基因大小的片段，與預(yù)期結(jié)果相符 (圖 5A)，同時(shí)利用基因特異性的上游引物和載體通用引物T7ter進(jìn)行PCR擴(kuò)增表明，10個(gè)質(zhì)粒都含有目的基因插入，并且均為正向插入，擴(kuò)增片段大小都和預(yù)期結(jié)果相符 (圖5B)，重組率為100%。

圖4 定向T載體pETG瓊脂糖凝膠電泳分析Fig. 4 Identification of directional T vector pETG by agarose gel electrophoresis. M: DNA marker; 1:pET23aM (3 666 bp); 2: pETG (4 649 bp); 3: pETG digested with Bfu I.

圖5 重組子的酶切 (A) 和PCR (B)鑒定Fig. 5 Identification of recombinants by restriction enzyme digestion and PCR. (A)Identification of recombinants by Nde I-Xho I restriction digestion. M: DNA marker; 1?10: Nde I-Xho I digested plasmids isolated from 10 blue colonies,respectively; 11: PETG digested by Nde I-Xho I. (B)The plasmid DNA from 10 independent blue colonies was amplified by PCR, PCR products were separated on a 1.5% agarose gel and visualized after EB straining. M: DNA marker; 1?10: PCR products of 10 recombinants isolated from 10 blue colonies, respectively; 11: PCR product of vector PETG.

2.4 蛋白質(zhì)表達(dá)和分析

本研究利用定向T載體成功地克隆了103個(gè)人類肝蛋白編碼基因，從中隨機(jī)挑選8個(gè)基因的克隆 (基因名稱和克隆效率見表2)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)后，SDSPAGE分析如圖6所示，8個(gè)pETG克隆經(jīng)誘導(dǎo)后在理論大小處均有蛋白條帶變粗，表明有目標(biāo)蛋白質(zhì)表達(dá) (圖6)，重組蛋白質(zhì)條帶割膠后經(jīng)質(zhì)譜鑒定證明為對(duì)應(yīng)的目標(biāo)蛋白質(zhì)。

3 討論

在當(dāng)代分子生物學(xué)研究當(dāng)中，無論研究的是已知基因還是未知基因，往往需要將擴(kuò)增的目的基因克隆入適當(dāng)?shù)妮d體中，以便用于各種分析。T載體克隆 PCR產(chǎn)物雖然已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，但是由于存在假陽性的問題，大量的資源和時(shí)間被浪費(fèi)在后續(xù)重組子篩選鑒定中；對(duì)于某些基因的特定功能研究還需要進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)，由于基因插入T載體的方向是隨機(jī)的，反向插入基因無法正常表達(dá)，理論上傳統(tǒng)T載體克隆方法最高只有50%的幾率獲得定向插入的重組子，利用傳統(tǒng) T載體進(jìn)行基因克隆和表達(dá)仍然需要耗費(fèi)大量時(shí)間、人力和物力用來抽提質(zhì)粒、鑒定基因的插入方向[7-8]。如何實(shí)現(xiàn)高通量基因克隆和表達(dá)，避免繁瑣的篩選重組子工作、降低實(shí)驗(yàn)研究的工作強(qiáng)度一直是分子生物學(xué)研究者所希望的。

表2 已表達(dá)的8個(gè)基因的克隆效率和理論蛋白分子量Table 2 Clone efficiency and protein theoretical molecular weight of 8 gene

圖6 SDS-PAGE分析重組蛋白Fig. 6 SDS-PAGE analysis of recombinant proteins. M: molecular mass standard protein. Control: BL21(DE3)/pETG.

目前利用傳統(tǒng)的 T載體進(jìn)行基因克隆存在兩大問題，一是假陽性問題無法避免，需要大量抽提轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定；二是基因插入方向不能定向，仍然需要大量人工篩選轉(zhuǎn)化子進(jìn)行插入方向鑒定。傳統(tǒng)方法利用GFP[14]，KillerRed[8,15]或者LacZ[6]等基因的表型缺失來淘汰不完全酶切的載體背景，該方法在一定程度上降低了篩選重組子的工作量，但是仍然無法避免線性化T載體異常重組和反向插入基因造成的背景干擾；商品化的Topo?TA克隆試劑盒可以實(shí)現(xiàn)基因的定向克隆，重組效率大約在90%，該方法同樣存在背景污染的問題，克隆仍然需要大量抽提質(zhì)粒并鑒定重組子，并且載體只能一次性使用，需要購買昂貴的試劑盒。本研究利用自制的定向 T載體和PCR片段連接重構(gòu)20 bp LacO序列來一步法表型篩選基因的插入和定向雙重事件。當(dāng)T載體和基因片段發(fā)生正確的連接反應(yīng)時(shí)，T載體上的13 bp 部分LacO序列將和PCR片段上的7 bp部分LacO序列重構(gòu)完整的20 bp LacO序列，重構(gòu)的LacO序列將競(jìng)爭性吸附宿主菌中的LacO結(jié)合蛋白 (LacI)，對(duì)宿主菌的 LacZ基因表達(dá)去抑制 (圖1)，該單菌落在X-gal底物平板上將變藍(lán)。該方法篩選重組子的方式比傳統(tǒng) T載體使用的LacZ alpha插入失活的遺傳篩選方式更為嚴(yán)謹(jǐn)，T載體自環(huán)化產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子、反向插入轉(zhuǎn)化子、T載體背景和 LacZ自發(fā)移碼轉(zhuǎn)化子都不會(huì)被篩選到，而僅僅只有目的基因定向插入，且20 bp LacO序列成功重構(gòu)的重組子可以被篩選到。由于該篩選方案是基于可見的表型獲得篩選，不同于傳統(tǒng)的表型缺失篩選，該篩選方法保證了克隆篩選的唯一正確性，如圖1所示的藍(lán)色轉(zhuǎn)化子抽提質(zhì)粒進(jìn)行鑒定后顯示定向插入重組效率為100%，所有被抽提的藍(lán)色轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒都含有定向插入的目的基因。

利用該定向T載體進(jìn)行基因克隆非常簡單、高效、可靠，不用購買商業(yè)的T載體試劑盒，還可以實(shí)現(xiàn)基因的定向插入；實(shí)驗(yàn)過程避免了繁瑣的篩選鑒定重組子工作；并且該定向T載體還可以實(shí)現(xiàn)基因的無縫克隆，表達(dá)的蛋白質(zhì)不會(huì)融合額外的非必要氨基酸序列。常規(guī)方法利用XcmⅠ、AhdⅠ、EcoR V制備T載體均會(huì)在克隆序列附近殘留部分酶切位點(diǎn)堿基序列，無法實(shí)現(xiàn)無縫克隆，當(dāng)進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)時(shí)，蛋白序列上會(huì)附加額外的氨基酸序列，該序列可能會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的表達(dá)或者功能表征有一定負(fù)面影響。本研究利用限制性內(nèi)切酶BfuⅠ酶切T載體實(shí)現(xiàn)了基因的無縫克隆，避免了非必要序列的融合。BfuⅠ屬于IIS型限制性內(nèi)切酶，其切割位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)之外，并且切割位點(diǎn)為識(shí)別位點(diǎn)下游第 5位任意的堿基(圖 3C)，通過 PCR擴(kuò)增 prrn-gfp引入兩個(gè)背向插入的BfuⅠ位點(diǎn)，其識(shí)別位點(diǎn)臨近prrn-gfp，當(dāng)制備線性化的T載體時(shí)，該限制性酶切位點(diǎn)被全部切除，不會(huì)殘留任何酶切位點(diǎn)序列，從而實(shí)現(xiàn)了基因的無縫融合，當(dāng)進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)時(shí)不會(huì)給蛋白質(zhì)序列融合額外的氨基酸序列，保證了蛋白質(zhì)序列的天然忠實(shí)性。

本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了一種新穎的定向T載體，利用該T載體成功的定向克隆了103個(gè)人類肝蛋白編碼基因。隨機(jī)挑選了其中8個(gè)基因的克隆進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)顯示8個(gè)基因?qū)?yīng)的蛋白質(zhì)均獲得成功表達(dá)。利用該定向T載體進(jìn)行基因的克隆和表達(dá)非常簡單、高效，不僅省去了大量復(fù)雜的鑒定重組子工作，實(shí)現(xiàn)了基因的定向插入、基因的無縫融合表達(dá)，還可以節(jié)約大量寶貴的科研時(shí)間，降低克隆成本，同時(shí)該定向T載體還兼容傳統(tǒng)的T載體基因克隆，有高通量大規(guī)?；蚩寺『捅磉_(dá)的應(yīng)用前景。

[1]Eisenberg D, Marcotte EM, Xenarios I, et al.Protein function in the post-genomic era. Nature,2000, 405(6788): 823?826.

[2]Vukmirovic OG, Tilghman SM. Exploring genome space. Nature, 2000, 405(6788): 820?822.

[3]Cha J, Bishai W, Chandrasegaran S. New vectors for direct cloning of PCR products. Gene, 1993,136(1/2): 369?370.

[4]Jeung JU, Cho SK, Shim KS, et al. Construction of two pGEM-7Zf(+)phagemid T-tail vectors using Ahd I-restriction endonuclease sites for direct cloning of PCR products. Plasmid, 2002, 48(2):160?163.

[5]Holton TA, Graham MW. A simple and efficient method for direct cloning of PCR products using ddT-tailed vectors. Nucleic Acids Res, 1991, 19(5):1156.

[6]Choi YJ, Wang TT, Lee BH. Positive selection vectors. Crit Rev Biotechnol, 2002, 22(3): 225?244.

[7]Ito Y, Suzuki M, Husimi Y. A T-extended vector using a green fluorescent protein as an indicator.Gene, 2000, 245(1): 59?63.

[8]Liu X, Liu X, Zhou Y, et al. T vector bearing KillerRed protein marker for red/white cloning screening. Anal Biochem, 2010, 405(2): 272?274.

[9]Cranenburgh RM, Lewis KS, Hanak JA. Effect of plasmid copy number and lac operator sequence on antibiotic-free plasmid selection by operator-repressor titration in Escherichia coli. J Mol Microbiol Biotechnol, 2004, 7(4): 197?203.

[10]Li MZ, Elledge SJ. MAGIC, an in vivo genetic method for the rapid construction of recombinant DNA molecules. Nat Genet, 2005, 37(3): 311?319.

[11]Zhu D, Zhong X, Tan R, et al. High-throughput cloning of human liver complete open reading frames using homologous recombination in Escherichia coli. Anal Biochem, 2010, 397(2):162?167.

[12]Sambrook J, Russell DW. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed. New York: Cold spring Harbor Laboratory Press, 2002.

[13]Chen X, Zhai C, Kang L, et al. High-level expression and characterization of a highly thermostable chitosanase from Aspergillus fumigatus in Pichia pastoris. Biotechnol Lett, 2012,34(4): 689?694.

[14]Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, et al. Green fluorescent protein as a marker for gene expression.Science, 1994, 263(5148): 802?805.

[15]Liu X, Shi R, Zou D, et al. Positive selection vector using the KillerRed gene. Anal Biochem, 2011 412(1): 120?122.