灰色鏈霉菌胰蛋白酶在變鉛青鏈霉菌中的異源表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)分析

馬騰博，令楨民，康振，李江華，堵國成，陳堅(jiān)

1 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122

2 江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122

3 江南大學(xué) 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122

4 江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122

胰蛋白酶 (Trypsin，EC 3.4.21.4)屬于絲氨酸蛋白酶類，是一種通過專一作用于精氨酸和賴氨酸所形成的肽鍵來催化蛋白質(zhì)水解的堿性蛋白酶。其最初是從牛胰腺泡中提取得到，后被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于豬、狗、鼠等哺乳動(dòng)物、昆蟲和海洋生物中[1]。目前，哺乳動(dòng)物胰蛋白酶，尤其是牛胰蛋白酶，被廣泛應(yīng)用于諸多工業(yè)領(lǐng)域。Wahlby等在鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)了胰蛋白酶，尤其以灰色鏈霉菌中胰蛋白酶的研究最為深入[2-4]。鏈霉菌源胰蛋白酶同哺乳動(dòng)物胰蛋白酶具有高度同源性且作用機(jī)理相似[5]，但因其成分相對單一，作用條件溫和，純化工藝簡單而受到越來越多研究者的關(guān)注。

灰色鏈霉菌胰蛋白酶 (SGT) 由 sprT基因(GenBank Accession No. M64471)編碼，其氨基酸序列由信號肽 (32個(gè)氨基酸)、前導(dǎo)序列 (4個(gè)氨基酸)和成熟酶 (223個(gè)氨基酸)三部分組成[6]。它是以無活性的酶原前體的形式合成、儲存以及分泌的，和哺乳動(dòng)物胰蛋白酶不同，SGT的分泌不需要外源激酶的切割，而是通過自催化作用產(chǎn)生有活性的成熟酶[6-7]。關(guān)于SGT野生酶的報(bào)道較早，但一直集中在酶學(xué)特性上，對產(chǎn)量的研究較少。Robert等在1975年就對其酶學(xué)和物理化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究[8]，SGT的晶體結(jié)構(gòu)也得到了進(jìn)一步的闡釋[9]，并被廣泛用作研究酶學(xué)動(dòng)力學(xué)的模型。sprT基因GC含量高達(dá)74%，具有嚴(yán)重的密碼子偏好性，在翻譯過程中需要形成3對二硫鍵，因此其活性表達(dá)存在一定難度。在SGT異源表達(dá)方面，國內(nèi)外報(bào)道較少，Page等將sprT成熟酶基因連接在pWB980載體上，以枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis WB700為宿主實(shí)現(xiàn)了其異源表達(dá)[10]。Kim等以變鉛青鏈霉菌Streptomyces lividans為宿主也實(shí)現(xiàn)了sprT基因的異源表達(dá)[11]，但酶活相對較低，其表達(dá)以pWHM3為載體，采用sprT自身啟動(dòng)子，強(qiáng)度較弱。我們曾嘗試以大腸桿菌 Escherichia coli和B. subtilis為宿主表達(dá)，結(jié)果都產(chǎn)生無活性包涵體。鏈霉菌宿主具有良好的生物安全性，同時(shí)能夠解決重組胰蛋白酶限制修飾、酶原切割以及對宿主毒性的問題[12-13]。因此，本研究選用紅霉素抗性基因啟動(dòng)子，以S. lividans為宿主，實(shí)現(xiàn)了胰蛋白酶的高效表達(dá)，并對重組酶酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)的比較分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

灰色鏈霉菌 Streptomyces griseus ATCC 10137來自美國典型菌種收藏所，變鉛青鏈霉菌Streptomyces lividans TK24、大腸-鏈霉菌的穿梭載體pIJ86均來自英國John Innes研究所，克隆質(zhì)粒pMDl8-T simple vector從TaKaRa公司購置。

1.1.2 培養(yǎng)基與抗生素

大腸桿菌采用 LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)時(shí)加入100 μg/mL氨芐青霉素。變鉛青鏈霉菌TK24液體生長培養(yǎng)基 (YEME)、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(R5)、固體平板生長培養(yǎng)基 (MS)配制方法參照文獻(xiàn)[14]，重組變鉛青鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基 (XSH、C5[15]、R2YE[14]、TSB[14]、SELF)配制方法見表 1，重組變鉛青鏈霉菌培養(yǎng)時(shí)加入 50 μg/mL安普霉素 (Apramycin)。

1.1.3 主要試劑和儀器

限制性內(nèi)切酶SphⅠ和BglⅡ、SolutionⅠ連接酶、DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量、DNA聚合酶均為TaKaRa公司產(chǎn)品。PCR產(chǎn)物純化試劑盒為上海生工生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。質(zhì)粒提取試劑盒為博凱思維公司產(chǎn)品。蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)和考馬斯亮藍(lán)蛋白濃度測定試劑盒為碧云天公司產(chǎn)品。其余藥品均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純化學(xué)試劑。本研究使用的主要儀器有：AKTA FPLC蛋白純化系統(tǒng)(Aamersham pharmacia biotech)；PCR儀 (Techne公司)；SDS-PAGE系統(tǒng) (Aamersham pharmacia biotech)；UV-2450光譜分光光度計(jì) (Shimadzu Co.，Kyoto，Japan)；Hitrap benzamidine FF 純化柱 (GE Healthcare)。

表1 重組鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基的組成Table 1 Composition of media for fermentation of recombinant strain

1.2 基因操作

1.2.1 S. griseus胰蛋白酶基因sprT的克隆

提取S. griseus ATCC 10137基因組，根據(jù)NCBI公布ATCC 10137胰蛋白酶CDS區(qū)基因序列 (sprT)，分別以其5′和3′端設(shè)計(jì)正反引物序列(表 2)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，其上下游引物分別加入 SphⅠ和 BglⅡ酶切位點(diǎn) (下劃線標(biāo)示)。PCR反應(yīng)的總體系為50 μL，以1 μL的灰色鏈霉菌基因組為模板PCR擴(kuò)增得到目的基因 sprT。反應(yīng)條件為：95 ℃5 min；95 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 40 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定、回收，采用TaKaRa公司PCR產(chǎn)物純化試劑盒 (操作見試劑盒說明書)純化后連接 pMDl8-T Simple Vector，轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109中，提取重組質(zhì)粒 pMDl8-T-sprT并用 SphⅠ、BglⅡ雙酶切，經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定、回收、純化后，用SolutionⅠ連接到同樣經(jīng)過 SphⅠ、BglⅡ雙酶切的pIJ86質(zhì)粒上，構(gòu)建重組表達(dá)載體pIJ86-sprT。轉(zhuǎn)化后提取質(zhì)粒經(jīng) PCR和雙酶切鑒定，篩選陽性克隆進(jìn)行測序分析。

表2 克隆目的基因sprT的引物Table 2 Primers for cloning of target genes

1.2.3 重組S. lividans TK24/pIJ86-sprT的構(gòu)建

將穿梭質(zhì)粒 pIJ86和重組穿梭質(zhì)粒pIJ86-sprT轉(zhuǎn)化S. lividans TK24原生質(zhì)體，TK24原生質(zhì)體的制備與DNA轉(zhuǎn)化參照Hopwood等鏈霉菌遺傳實(shí)驗(yàn)手冊[14]。轉(zhuǎn)化后涂布R5再生固體培養(yǎng)基平板，培養(yǎng) 24 h后在平板表面均勻添加50 μg/mL的安普霉素，培養(yǎng)48 h篩選得到陽性菌落，挑選陽性轉(zhuǎn)化子劃線轉(zhuǎn)接MS固體培養(yǎng)基，得到重組菌株TK24/ pIJ86和TK24/pIJ86-sprT。

1.3 重組胰蛋白酶在S. lividans TK24中表達(dá)

分別將重組菌株TK24/pIJ86和TK24/pIJ86-sprT鏈霉菌孢子接種于 100 mL含有安普霉素(50 μg/mL)的種子培養(yǎng)基R2YE中，于30 ℃搖床 (轉(zhuǎn)速200 r/min)培養(yǎng)24 h后，按5%的接種量轉(zhuǎn)接50 mL鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基XSH (50 μg/mL安普霉素，放置2個(gè)槍頭用于攪拌)，30 ℃搖床(轉(zhuǎn)速200 r/min)培養(yǎng)。發(fā)酵第3天開始取樣，之后每兩天取樣，采用BAPNA法測定酶活。樣品處理后經(jīng)SDS-PAGE檢測，聚丙烯酰胺凝膠采用碧云天蛋白電泳試劑制備。

1.4 產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

將篩選出的重組菌株 TK24/pIJ86-sprT均勻涂布在MS固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3 d，對菌株進(jìn)行活化，使其處于良好的生長狀態(tài)，將活化后的重組菌株的孢子接種至種子培養(yǎng)基 R2YE(50 mL/250 mL)中，200 r/min、30 ℃培養(yǎng)24 h后，以 5%的接種量轉(zhuǎn)接不同的發(fā)酵培養(yǎng)基R2YE、SELF、C5、TSB (50 mL/500 mL)，第 3天開始取樣，之后每兩天取樣，采用BAPNA法測定酶活。

1.5 酶活測定

1.5.1 BAPNA測定法

[16]的方法進(jìn)行測定：N-苯甲酰-DL-精氨酸-硝基苯胺 (BAPNA)是一種含有酰胺鍵的合成物，胰蛋白酶對酰胺鍵有專一的水解能力，因此BAPNA測定法是一種通過檢測胰蛋白酶對酰胺鍵的消化情況來測定胰蛋白酶活力的方法。底物為890 μL反應(yīng)緩沖液 (50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，20 mmol/L CaCl2)與 10 μL BAPNA (100 mmol/L)的混合物，將此底物在37 ℃下預(yù)熱5 min后，加入100 μL酶液迅速混合均勻，37 ℃反應(yīng)2 min，測其在410 nm處吸光值的變化情況。在上述條件下，每分鐘A410升高0.1為一個(gè)酶活。胰蛋白酶酰胺鍵水解活力計(jì)算公式如下：

1.5.2 BAEE測定法

參考文獻(xiàn)[16]的方法進(jìn)行測定：N--苯甲酰-L-精氨酸鹽酸乙酯是一種含有酯鍵的合成物，胰蛋白酶能夠?qū)Ｒ坏厮怩ユI，BAEE測定法就是一種通過酯鍵的水解來檢測吸光值的變化從而計(jì)算出胰蛋白酶活力的方法。底物為3 mL BAEE緩沖溶液 (67 mmol/L的磷酸鈉緩沖液，pH 7.6，0.25 mmol/L BAEE)，將此底物在25 ℃預(yù)熱5 min后，加入200 μL酶液迅速混合均勻，25 ℃反應(yīng)2 min，測其在253 nm處吸光值的變化情況。在上述條件下，每分鐘A253升高0.001為一個(gè)酶活。胰蛋白酶酯鍵水解活力計(jì)算公式如下：

1.6 重組胰蛋白酶的分離與純化

參照文獻(xiàn)[16]和[17]的方法：取500 mL重組菌株發(fā)酵產(chǎn)物，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，將所得發(fā)酵上清液用0.22 μm的PVDF水膜過濾后，流經(jīng)Hitrap benzamidine FF純化柱 (Φ1.6 cm×2.5 cm，CN17-5144-01，GE公司)，先用緩沖液A (50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，0.5 mol/L NaCl)洗去未特異結(jié)合于柱上的雜蛋白，再用緩沖液B(50 mmol/L甘氨酸，10 mmol/L HCl，pH 3.0)洗脫，收集洗脫下來的色譜峰，得到純化后樣品。12% SDS-PAGE分析純化后樣品條帶，考馬斯亮藍(lán)試劑盒 (碧云天P0006)測定純化后蛋白濃度。

1.7 重組胰蛋白酶rSGT與牛胰蛋白酶BT的酶學(xué)性質(zhì)比較

1.7.1 rSGT和BT最適溫度及溫度穩(wěn)定性比較

選用 BAPNA測定法，在不同溫度條件下(10 ℃ ～ 70 ℃ )分別測定rSGT和BT活力；將純化后的rSGT和BT純酶液分別在不同溫度下保溫不同的時(shí)間 (10、20、30、40、50、60 min)，檢測剩余的酶活力。

1.7.2 rSGT和BT最適pH及pH穩(wěn)定性比較

選用BAPNA測定法，在不同pH反應(yīng)條件下 (pH 3.0～12.0)分別測定rSGT和BT的活力；將純化后的rSGT和BT純酶液分別在不同pH值的緩沖液中37 ℃保溫1 h，檢測剩余的酶活力。

1.7.3 rSGT和BT酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較

選用BAPNA測定法和BAEE測定法，分別選擇合適的底物濃度，以系列稀釋的底物溶液測定酶動(dòng)力曲線，根據(jù)雙倒數(shù)作圖法求得在兩種底物反應(yīng)條件下 rSGT和 BT的 Km、Vmax、kcat和kcat/Km數(shù)值。

1.7.4 金屬離子對rSGT和BT活力的影響比較

分別在BAPNA和BAEE兩種底物的反應(yīng)體系中加入不同濃度的金屬離子，使 Ca2+和 Mg2+的最終濃度為1 mmol/L，其余金屬離子的終濃度為0.5 mmol/L，以不加金屬離子的反應(yīng)體系的酶活定義100%，在兩種底物反應(yīng)條件下分別測定加入金屬離子后各反應(yīng)體系中rSGT和BT的相對酶活。

1.7.5 抑制劑和有機(jī)溶劑對rSGT和BT活力的影響比較

在兩種底物和酶的反應(yīng)體系中，分別加入不同的蛋白抑制劑和有機(jī)溶劑，以不加任何蛋白抑制劑和有機(jī)溶劑的反應(yīng)體系的酶活定義100%，測定rSGT和BT的相對酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒pIJ86-sprT的構(gòu)建

以 ATCC 10137基因組為模板，利用引物Psb1、Psb2，PCR擴(kuò)增出sprT，產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見在780 bp附近的擴(kuò)增條帶。純化后的 PCR 產(chǎn)物和 pMD18-T Simple Vector 連接后，與 pIJ86質(zhì)粒同時(shí)用 SphⅠ和BglⅡ雙酶切，純化后連接，得到重組穿梭質(zhì)粒pIJ86-sprT (圖1)。酶切鑒定表明重組載體構(gòu)建成功。測序結(jié)果與NCBI登記序列相一致。本研究選用攜帶紅霉素抗性基因啟動(dòng)子 (PermE)的pIJ86質(zhì)粒為載體，成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pIJ86-sprT，與sprT自身啟動(dòng)子 (Ptry[6])相比，PermE具有更高的強(qiáng)度 (圖2)。

圖1 重組穿梭質(zhì)粒pIJ86-sprT的構(gòu)建Fig. 1 Construction of the recombinant shuttle plasmid pIJ86-sprT.

2.2 pIJ86-sprT在TK24中的表達(dá)

分別將質(zhì)粒pIJ86和重組質(zhì)粒pIJ86-sprT轉(zhuǎn)化至原生質(zhì)體S. lividans TK24挑取陽性轉(zhuǎn)化子，命名為TK24/pIJ86和TK24/pIJ86-sprT。將重組菌株接種至 100 mL種子培養(yǎng)基 R2YE中，200 r/min、30 ℃搖床培養(yǎng)24 h，以5%接種量轉(zhuǎn)接鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基XSH，從第3天開始取樣，之后每隔一天取樣，將1 mL樣品5 000 r/min離心5 min，得發(fā)酵上清液。根據(jù)BAPNA法測定酶活，對照重組菌TK24/pIJ86基本檢測不到酶活，攜帶重組質(zhì)粒的TK24/pIJ86-sprT菌株第3天可以檢測到酶活，到第9天酶活最高可達(dá)3.56 U/mL(圖 3)。為進(jìn)一步確定重組蛋白表達(dá)，利用SDS-PAGE電泳檢測蛋白條帶，在預(yù)測的28 kDa處有明顯的特異性表達(dá)條帶，如圖4所示。

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

圖2 PermE和Ptry的序列比較Fig. 2 Comparison of the sequences of PermE and Ptry. The putative ?10 and ?35 regions are underlined and in bold.

圖3 重組TK24/pIJ86-sprT發(fā)酵過程中的胰蛋白酶酶活曲線Fig. 3 The curve of trypsin activity during fermentation of recombinant TK24/pIJ86-sprT.

圖4 重組TK24/pIJ86-sprT蛋白表達(dá)的SDS-PAGE分析Fig. 4 SDS-PAGE analysis of expression proteins in recombinant TK24/pIJ86-sprT. M: protein marker; 1:recombinant TK24/pIJ86-sprT; 2: recombinant TK24/pIJ86.

圖5 不同發(fā)酵培養(yǎng)對重組TK24/pIJ86-sprT產(chǎn)胰蛋白酶的影響Fig. 5 Effects of different media on production of trypsin from TK24/pIJ86-sprT.

將篩選出的重組菌株 TK24/pIJ86-sprT涂布于MS固體培養(yǎng)基上活化，使其處于良好的生長狀態(tài)，將活化后重組菌株的孢子接種至種子培養(yǎng)基 R2YE (50 mL/250 mL)中，200 r/min、30 ℃培養(yǎng)24 h，以5%的接種量轉(zhuǎn)接不同的發(fā)酵培養(yǎng)基 R2YE、SELF、C5、TSB (50 mL/500 mL)，第3天開始取樣，之后每隔一天取樣，測定酶活，結(jié)果如圖5所示。從圖中可以看出，R2YE在第11天酶活最高達(dá)9.21 U/mL，SELF在第7天酶活最高達(dá) 8.61 U/mL，C5在第 7天酶活最高達(dá)3.36 U/mL，TSB在第5天酶活最高達(dá)3.73 U/mL。以上結(jié)果表明，以R2YE作為發(fā)酵培養(yǎng)基可獲得最高酶活9.21 U/mL，但發(fā)酵周期較長；以SELF為發(fā)酵培養(yǎng)基，雖然最高酶活為8.61 U/mL，但在第7天便得到最高值，相比以R2YE作為發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵周期縮短。因此選取SELF培養(yǎng)基為重組菌發(fā)酵培養(yǎng)基。

2.4 重組胰蛋白酶的分離與純化

將純化的重組胰蛋白酶進(jìn)行 SDS-PAGE電泳，如圖6所示，其蛋白條帶顯示其相對分子質(zhì)量約為28 kDa，與報(bào)道基本一致，且蛋白帶純度可以用于酶學(xué)性質(zhì)檢測。

2.5 rSGT與BT的酶學(xué)性質(zhì)比較

2.5.1 rSGT和BT最適溫度及溫度穩(wěn)定性比較

圖6 純化后rSGT的SDS-PAGE分析Fig. 6 SDS-PAGE analysis of the purified rSGT. 1:purified rSGT; 2: protein marker.

rSGT和BT的最適溫度和溫度穩(wěn)定性見圖7。由圖7A可知，兩者的最適溫度都在50 ℃左右，在10 ～50 ℃℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，rSGT和BT的活力均成上升趨勢，當(dāng)溫度高于50 ℃，兩種酶活力迅速降低，70 ℃時(shí)催化活性趨近于零；在圖7B和7C中，BT在30 ℃～40 ℃均能保持較高活力 (＞80%)，且在30 ℃幾乎沒有酶活損失，50 ℃處理60 min仍能保持42.45%的酶活力；rSGT在30 ℃也能保持較高活力，但在40 ℃時(shí)活力明顯下降，但在40 min內(nèi)仍能保持50%以上的活力，50 ℃～70 ℃活力迅速下降，10 min后基本檢測不到酶活。表明雖兩者最適溫度均在50 ℃左右，但從穩(wěn)定性來看，作用溫度在30 ℃～40 ℃之間更為合理，且相對于BT，rSGT在40 ℃～50 ℃穩(wěn)定性更差。

2.5.2 rSGT和BT最適pH 及pH 穩(wěn)定性比較

圖8A中，在不同pH反應(yīng)條件下分析rSGT和BT活力，發(fā)現(xiàn)兩者均在中性偏堿性環(huán)境下有較高的催化活性，最適反應(yīng)pH為7.5～10，與BT相比，rSGT具有較高的酸度耐受性，在pH 5.0的條件下也能保持 60%以上的催化活性。但從穩(wěn)定性上來看 (圖8B)，rSGT和BT在酸性和中性條件下放置1 h后活力幾乎沒有受到影響，在pH 8.0條件下測定酶活力均保持在 90%以上，而在 pH＞9.0條件下放置，rSGT和BT活力都有不同程度的降低，pH 12.0條件下，rSGT活力降低到40%以下。

圖7 rSGT和BT的最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性的比較分析Fig. 7 Comparative analysis of the optimal reaction temperature and thermostability of rSGT and BT. (A)The optimal reaction temperature of rSGT and BT. (B)The thermostability of BT. (C)The thermostability of rSGT.

圖8 rSGT和BT的最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性的比較分析Fig. 8 Comparative analysis of the optimal reaction pH and pH stability of rSGT and BT. (A)The optimal reaction pH of rSGT and BT. (B)The pH stability of rSGT and BT.

2.5.3 rSGT和BT酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較

分別選用BAPNA測定法和BAEE測定法，分析 BT和 rSGT在這兩種底物反應(yīng)條件下的Km、Vmax、kcat和 kcat/Km(表 3)。rSGT 與 BAPNA和BAEE兩種底物反應(yīng)的Km相近，但水解酯鍵(BAEE) 的最大反應(yīng)速率、轉(zhuǎn)換常數(shù) (Kcat)和催化效率 (Kcat/Km)則分別是水解酰胺鍵(BAPNA)的8倍、13倍和15倍；BT對兩種底物的特異性有明顯差別，與 BAPNA反應(yīng)的 Km是與BAEE反應(yīng)Km的30倍，其對酯鍵的水解活力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于酰胺鍵，與報(bào)道的大多數(shù)魚類及甲殼類動(dòng)物相近[18]。選用BAPNA做底物時(shí)，BT的Km是rSGT的10倍，由此可見rSGT對酰胺鍵的特異性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于 BT，其最大反應(yīng)速率、轉(zhuǎn)化常數(shù)和催化效率分別是BT的2倍、3倍和27倍，而采用 BAEE作為底物，BT的特異性略高于rSGT，催化效率相同，但反應(yīng)速率和轉(zhuǎn)換常數(shù)均小于rSGT。

2.5.4 金屬離子對rSGT和BT活力的影響比較

各種金屬離子對rSGT和BT活力的影響如表4所示，在兩種底物反應(yīng)條件下，rSGT和BT均能被1 mmol/L的Ca2+激活[19]，被0.5 mmol/L的 Cu2+、Pb2+、Co2+、Ag+、Hg2+抑制，其中 Cu2+、Pb2+、Co2+對rSGT和BT與兩種底物反應(yīng)的抑制作用均較弱，Ag+對rSGT和BT與BAPNA反應(yīng)的抑制作用不明顯，而對rSGT和BT與BAEE反應(yīng)的抑制作用較強(qiáng)，在 Hg2+存在條件下，BT與BAEE反應(yīng)，酶活力被完全抑制，而rSGT與BAEE作用只有較弱的抑制作用。Mg2+對兩種底物的作用效果不明顯，Zn2+對 rSGT和 BT與BAPNA的反應(yīng)有一定的抑制作用，但對 rSGT和BT與BAEE的反應(yīng)卻有一定的激活作用。由于rSGT和BT在結(jié)構(gòu)和功能上的相似性，不同金屬離子對rSGT和BT活力的影響也表現(xiàn)出一定的相似性，但在與兩種底物的反應(yīng)中，Ag+、Hg2+和Zn2+對rSGT和BT酰胺酶和酯酶的催化活力表現(xiàn)出了一定的差異。

表3 rSGT和BT在兩種底物反應(yīng)條件下的動(dòng)力學(xué)參數(shù)的比較Table 3 Comparison of kinetic properties of rSGT and BT with two kinds of substrates

表4 在兩種底物反應(yīng)條件下各種金屬離子對rSGT和BT活力的影響Table 4 Effect of different metallic ions on rSGT and BT activity with two kinds of substrates

2.5.5 抑制劑和有機(jī)溶劑對rSGT和BT活力的影響比較

抑制劑和有機(jī)溶劑對rSGT和BT活力的影響見表5，在兩種底物反應(yīng)條件下，CEOM、SBTI和Benzamidine都能強(qiáng)烈抑制rSGT和BT的活力，與 CEOM、SBTI和 Benzamidine能抑制甲殼類動(dòng)物、魚和高等脊椎動(dòng)物的胰蛋白酶活力的報(bào)道相符[18]。PMSF是一種常見的絲氨酸蛋白酶抑制劑，能夠一定程度地抑制rSGT和BT的活力，對酯鍵 (BAEE)的抑制作用明顯大于對酰胺鍵 (BAPNA)的抑制作用。TPCK對rSGT和BT與兩種底物的反應(yīng)均有抑制作用，但抑制作用較弱。在以BAPNA為底物時(shí)，25%的甲醇、乙醇、甘油、丙酮和DMSO對BT均有一定的抑制作用，但對rSGT卻幾乎沒有抑制，反而使其活力增強(qiáng)，表明當(dāng)作用于酰胺鍵時(shí)，rSGT的有機(jī)溶劑耐受性要強(qiáng)于BT，甚至有機(jī)溶劑的存在有利于rSGT活力的提高。在以BAEE為底物時(shí)，不同有機(jī)溶劑對rSGT和BT活力的影響不同，甲醇、DMSO對rSGT和BT活力有促進(jìn)作用，乙醇和丙酮對rSGT和BT有抑制作用，在丙酮存在的條件下，兩者的活力被完全抑制。

表5 在兩種底物反應(yīng)條件下各種抑制劑和有機(jī)溶劑對rSGT和BT活力的影響Table 5 Effect of different inhibitors and organic solvents on rSGT and BT activity with two kinds of substrates

3 討論

本研究應(yīng)用紅霉素抗性基因啟動(dòng)子，以S. lividans為表達(dá)宿主，成功實(shí)現(xiàn)了胰蛋白酶的高效表達(dá)，在此基礎(chǔ)上，系統(tǒng)對重組酶酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了分析。關(guān)于灰色鏈霉菌胰蛋白酶的異源表達(dá)研究，國內(nèi)外報(bào)道相對較少。在2003年，Page等將 sprT基因克隆至質(zhì)粒 pWB980[20]，并采用來自 B. subtilis的 sacB信號肽，在 B. subtilis WB700[21]中實(shí)現(xiàn)了其異源表達(dá)[10]。但是，在B. subtilis中的相關(guān)研究報(bào)道僅此一篇。此前，我們根據(jù)其敘述方法進(jìn)行了構(gòu)建并應(yīng)用 B. subtilis WB700進(jìn)行了表達(dá)驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，采用B. subtilis并不能實(shí)現(xiàn)sprT的異源活性表達(dá) (獲得大量包涵體，數(shù)據(jù)未顯示)。此外，我們也嘗試了在E. coli 中表達(dá)，和B. subtilis中的結(jié)果類似，也沒有得到活性表達(dá)。顯然，具有3對二硫鍵灰色鏈霉菌胰蛋白酶并不適合在B. subtilis和E. coli中表達(dá)。近日，令楨民等應(yīng)用真核表達(dá)系統(tǒng)，成功實(shí)現(xiàn)了灰色鏈霉菌胰蛋白酶在畢赤酵母Pichia pastoris中的活性表達(dá)[16]，進(jìn)一步說明胰蛋白酶中二硫鍵的形成可能是制約其活性表達(dá)的關(guān)鍵。

國內(nèi)外關(guān)于胰蛋白酶的相關(guān)研究主要集中在 S. griseus以及同一屬的其他菌株，如S. lividans。Kim等將含有sprT自身啟動(dòng)子 (Ptry)和編碼基因的全基因片段連接到鏈霉菌克隆質(zhì)粒pWHM3上，在S. lividans中實(shí)現(xiàn)了胰蛋白酶的表達(dá)，最高酶活達(dá)到0.74 U/mL[11]。而本研究選用pIJ86為表達(dá)質(zhì)粒，同樣以菌株 S. lividans TK24為宿主，采用 SELF發(fā)酵培養(yǎng)基，最高酶活達(dá)8.61 U/mL，比報(bào)道結(jié)果提高了11.6倍。pIJ86表達(dá)質(zhì)粒攜帶紅霉素抗性基因啟動(dòng)子 (PermE)，該啟動(dòng)子來源于紅色糖多孢菌的紅霉素合成基因簇，位于ermE和eryC之間，是鏈霉菌組成型表達(dá)的強(qiáng)啟動(dòng)子。它有2個(gè)啟動(dòng)區(qū)域PermEⅠ和Ⅱ，含有2對相同方向的?10、?35區(qū)和 2個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn) (圖 2)。而 Kim 等[6]所采用的 sprT自身啟動(dòng)子 (Ptry)只含有一個(gè)啟動(dòng)區(qū)域，其?35區(qū)與PermE Ⅱ的?35區(qū)相同，且Ptry的?35區(qū)和?10區(qū)保守序列的間隔也同PermEⅡ相似 (圖2)。比較發(fā)現(xiàn)，與Ptry相比，PermE多出一個(gè)啟動(dòng)區(qū)域PermEⅠ，從而使啟動(dòng)子強(qiáng)度增加。此外，在S. griseus中，胰蛋白酶參與其生理生化的多種調(diào)節(jié)[22]，sprT基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)調(diào)控復(fù)雜[23-24]，因此，在同屬的S. lividans中采用sprT基因的自身啟動(dòng)子同樣不利于 sprT的表達(dá)。由此可見，以菌株S. lividans為表達(dá)宿主，啟動(dòng)子的強(qiáng)度是影響胰蛋白酶表達(dá)的重要因素。

此外，為進(jìn)一步提高產(chǎn)量，本研究比較了5種鏈霉菌常用培養(yǎng)基，結(jié)果表明以R2YE和SELF為發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)酶活最高，分別為9.21 U/mL和8.61 U/mL。與其他 3種培養(yǎng)基相比，R2YE和SELF均含有少量游離氨基酸，且R2YE中還含有一些微量元素和緩沖鹽成分。可見，其高效表達(dá)需要多種成分的相互協(xié)作，一些微量成分也是影響鏈霉菌菌絲生長以及高效表達(dá)的重要因素。

關(guān)于野生鏈霉菌胰蛋白酶 SGT酶學(xué)性質(zhì)的報(bào)道較多，但對重組酶酶學(xué)性質(zhì)則缺少系統(tǒng)詳盡的報(bào)道。Page等對重組酶和野生酶的底物特異性進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)兩者降解精氨酸和賴氨酸的最佳比例均為4：1[10]。Kim等研究了溫度及pH對野生酶和重組酶活力的影響，發(fā)現(xiàn)兩者并無明顯差別[15]。本文基于純化的重組鏈霉菌胰蛋白酶(rSGT)，對其酶活性質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，結(jié)果表明其酶學(xué)性質(zhì)與SGT以及BT在最適溫度、最適pH以及抑制劑的影響等方面表現(xiàn)出極大的相似性[8,25-26]。但在耐酸性上，rSGT具有更大的潛力，在pH 5.0時(shí)還能保持60%以上的活力，而其他報(bào)道的胰蛋白酶在pH≤6.0時(shí)，穩(wěn)定性就急劇下降[8,15,18,25]。同時(shí)，我們還測定了rSGT在兩種常用底物下Km值，雖與報(bào)道的SGT相比，rSGT對兩種底物的特異性都有所降低，但其對酰胺健底物的特異性仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于 BT。此外，我們研究了不同金屬離子對rSGT酰胺酶和酯酶活力的影響，基本與SGT的報(bào)道相符，但發(fā)現(xiàn)Zn2+對rSGT的酯酶活力有促進(jìn)作用而對其酰胺酶活力有抑制作用。和其他胰蛋白酶相關(guān)報(bào)道不同[25]，rSGT的酰胺酶活力在添加了終濃度為 25%的有機(jī)溶劑后沒有受到抑制反而有所提高 (表5)。

綜上所述，本研究結(jié)果為胰蛋白酶在食品、醫(yī)藥、皮革等諸多工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)和選擇思路，并為后期鏈霉菌胰蛋白酶分子水平上的突變和性質(zhì)改造 (提高耐熱性能)明確了方向。

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