重組a-氨基酸酯水解酶合成頭孢曲嗪

潘佳林，王輅，李端華，葉麗娟

中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)總公司四川抗菌素工業(yè)研究所，四川 成都 610052

頭孢曲嗪為半合成的廣譜口服頭孢菌素，對(duì)b-內(nèi)酰胺酶具有很高的穩(wěn)定性[1]。用于制備頭孢曲嗪的原料成本低于頭孢克洛，臨床療效與頭孢克洛類(lèi)似[2]。因此，頭孢曲嗪可作為頭孢克洛的替代品種，市場(chǎng)潛力巨大。目前頭孢曲嗪的制備方法主要為化學(xué)方法，一方面殘留的溶劑威脅患者的用藥安全，另一方面產(chǎn)生的廢棄溶媒造成一定的環(huán)保壓力。室溫條件下和在中性水溶液中進(jìn)行的酶催化合成具有更高的能效和更低的碳排放量[3]，利用酶法合成路線代替化學(xué)合成路線可以產(chǎn)生巨大的環(huán)境和社會(huì)效益[4-5]。

雖然近年來(lái)酶法合成頭孢類(lèi)抗生素的研究比較廣泛[6-8]，但目前還沒(méi)有關(guān)于頭孢曲嗪酶法合成工藝的文獻(xiàn)報(bào)道。a-氨基酸酯水解酶(a-Amino acid ester hydrolase，簡(jiǎn)稱 AEH，EC 3.1.1.43) 是一類(lèi)具備頭孢曲嗪合成活性的酶。1972年由Takahashi等在尋找能夠合成帶a-氨基的抗生素的過(guò)程中被發(fā)現(xiàn)[9]。由于底物范圍限于帶a-氨基的?；w，而且相比酰胺，對(duì)酯的親和性更高而得名[10]。AEH同時(shí)催化3個(gè)反應(yīng) (圖1)：1)催化酰胺鍵的形成，酶發(fā)揮抗生素合成酶活性；2)催化?；w的水解；3)催化產(chǎn)物的水解，酶發(fā)揮酰胺酶活性[11]。酶法合成頭孢類(lèi)抗生素可以通過(guò)熱力學(xué)控制 (Thermodynamically controlled synthesis，TCS)[12]或者動(dòng)力學(xué)控制(Kinetically controlled synthesis，KCS)[13]來(lái)實(shí)現(xiàn)。與熱力學(xué)合成不同，動(dòng)力學(xué)控制最終的轉(zhuǎn)化率不是由平衡狀態(tài)決定，而是由3個(gè)反應(yīng)的速率共同決定[14]。動(dòng)力學(xué)控制的反應(yīng)其特點(diǎn)是存在暫時(shí)的最大轉(zhuǎn)化率[15]。由于產(chǎn)物濃度不再受反應(yīng)平衡的限制，對(duì)于高轉(zhuǎn)化率意味著低成本的制藥工業(yè)來(lái)說(shuō)，動(dòng)力學(xué)無(wú)疑是比熱力學(xué)更好的策略。本文從AEH的異源表達(dá)開(kāi)始，采用純化的重組酶催化合成頭孢曲嗪，以動(dòng)力學(xué)控制策略考察了特定條件下頭孢曲嗪的轉(zhuǎn)化率。

圖1 AEH催化的頭孢曲嗪的合成Fig. 1 Synthesis of cefatrizine by AEH.

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

紅紋黃單胞菌 Xanthomonas rubrillineans CPCC 140817由中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)四川抗菌素工業(yè)研究所保藏；E. coli BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京天根生化公司?？寺≥d體pGEM-T、表達(dá)載體pET28分別為Promega公司和Invitrogen公司產(chǎn)品。

1.2 引物與試劑

引物合成與測(cè)序由上海 Invitrogen公司完成。用于克隆的聚合酶為上海生工生物工程公司Pfu聚合酶，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ購(gòu)自Fermentas公司，質(zhì)粒小量提取采用Bio-Tek公司的OMEGA試劑盒。BCA蛋白含量測(cè)定試劑盒為Pierce公司產(chǎn)品。親和層析柱 (FF crude，5 mL)購(gòu)自GE Healthcare公司。超濾離心管 (Amicon，Ultra-15，50 kDa)為 Millipore公司產(chǎn)品。Sephadex G-200購(gòu)自Pharmacia公司。

頭孢氨芐標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自石家莊華北制藥集團(tuán)。7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸 (7-ADCA)、苯苷氨酸甲酯鹽酸鹽 (PGM·HCl)、對(duì)羥基苯苷氨酸甲酯鹽酸鹽 (HPGM·HCl)為上海邦成化工有限公司產(chǎn)品，7-氨基-3-(1, 2, 3-三唑-4-硫基)甲基頭孢烷酸 (7-ATTC)及頭孢曲嗪標(biāo)準(zhǔn)品由四川抗菌素工業(yè)研究所化學(xué)部提供 (純度≥98%)。其他試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 aeh基因的克隆及轉(zhuǎn)化大腸桿菌

采用 PCR擴(kuò)增方法從紅紋黃單胞菌X. rubrillineans CPCC 140817的全基因組中分離aeh基因。引物序列如下: 正向: 5'-CGGAATTC A TGCGCCGCATCGCTCCCTGCCTGC-3', 反向:5'-CCGCTCGAGTCAATGTACCGGCAGCTGAT GAAAC-3' (下劃線為限制性酶切位點(diǎn))。PCR反應(yīng)體系：基因組DNA約100 ng，引物10 pmol/L，dNTPs 200 pmol/L，1×PCR緩沖液，Taq酶 1.5 U，ddH2O補(bǔ)足總體系至25 μL。梯度PCR反應(yīng)程序如下：94 ℃ 3 min；98 ℃ 30 s，50～58 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，20 個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min。將 PCR產(chǎn)物克隆到pGEM-T載體中，測(cè)序驗(yàn)證后，再將pGEM-T-aeh和 pET28載體經(jīng)EcoRⅠ和 XhoⅠ酶切后回收，相連并轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3)。

1.3.2 重組AEH的酶活測(cè)定

以頭孢氨芐合成活性跟蹤 AEH的純化過(guò)程。頭孢氨芐合成活性測(cè)定方法如下：30 mmol/L 7-ADCA、15 mmol/L PGM·HCl溶于 50 mmol/L pH 6.2的磷酸鈉緩沖液，酶的加量為50 μL酶溶液/(mL反應(yīng)混和物)，30 ℃下溫育30 min。1 min生成1 μmol頭孢氨芐所需的酶量定義為1個(gè)活力單位 (1 U)。HPLC 法測(cè)定反應(yīng)生成頭孢氨芐的量[16]。

1.3.3 重組AEH的表達(dá)及分離純化

在10 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)重組大腸桿菌。培養(yǎng)液裝量6 L，培養(yǎng)液組成：乳糖1 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，卡那霉素30 mg/L，聚醚消泡劑1 mL/L。接種量1%。發(fā)酵條件：溫度25 ℃；通氣量9 L/min；攪拌轉(zhuǎn)速250 r/min。發(fā)酵周期24 h。

發(fā)酵結(jié)束后，冷凍離心機(jī)5 000×g離心收集菌體。參考Sambrook的方法[17]制備無(wú)細(xì)胞提取物。表達(dá)的蛋白N-端帶有6×His標(biāo)簽，選擇親和層析純化無(wú)細(xì)胞提取物。6個(gè)柱體積的結(jié)合緩沖液 (20 mmol/L磷酸鈉，500 mmol/L NaCl，pH 7.8)洗柱后，以5 mL/min流速上樣。依次用洗滌緩沖液 (10 mmol/L咪唑，20 mmol/L磷酸鈉，500 mmol/L NaCl，pH 7.8)、洗脫緩沖液(50 mmol/L咪唑，20 mmol/L磷酸鈉，500 mmol/L NaCl，pH 7.8)洗柱，分布收集洗脫液。最后用含有更高濃度咪唑的緩沖液洗柱 (200 mmol/L咪唑，20 mmol/L磷酸鈉，500 mmol/L NaCl，pH 7.8)。經(jīng)過(guò)SDS-PAGE分析，合并目標(biāo)蛋白純度較高的收集管，超濾離心管去除小分子鹽并濃縮酶溶液。

分離純化每一步獲得的酶液按 1.3.2項(xiàng)下測(cè)量酶活。Pierce BCA蛋白含量測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白含量。

1.3.4 重組AEH亞基分子量的測(cè)定

變性聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定亞基分子量。SDS-PAGE分析條件：10%分離膠，5%濃縮膠，上樣量15 μL。采用Bio-Rad公司Powerpac Basic電泳系統(tǒng)，分子量標(biāo)準(zhǔn)為 Fermentas PageRuler Prestained Protein Ladder，考馬斯亮藍(lán)染色。

1.3.5 重組AEH合成頭孢曲嗪最適反應(yīng)pH與最適反應(yīng)溫度的確定

采用不同pH值的緩沖體系，分別測(cè)定重組AEH合成頭孢曲嗪的反應(yīng)初速度，確定重組AEH催化頭孢曲嗪合成的最適pH值。30 mmol/L 7-ATTC、15 mmol/L HPGM×HCl溶于 50 mmol/L不同pH的緩沖液。pH 5.5～6.0，采用Na2HPO4-檸檬酸緩沖液；pH 6.5～7.5，采用 Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液。酶加量為50 μL酶溶液/(mL反應(yīng)混和物)，30 ℃下溫育30 min。測(cè)定生成的頭孢曲嗪的量。

在最適 pH條件下，測(cè)定不同溫度下重組AEH催化頭孢曲嗪合成的反應(yīng)過(guò)程。30 mmol/L 7-ATTC、15 mmol/L HPGM×HCl溶于 50 mmol/L Na2HPO4-檸檬酸緩沖液 (pH 6.0)，酶加量為50 μL酶溶液/(mL反應(yīng)混和物)，分別在28 ℃、32 ℃、36 ℃、40 ℃下溫育180 min，測(cè)定生成的頭孢曲嗪的量。

1.3.6 兩底物最佳摩爾比的確定

底物溶液配置：以初始反應(yīng)體積100 mL計(jì)算所需2種底物的量。0.3 mol/L的磷酸鈉緩沖液(pH 7.5)溶解0.94 g 7-ATTC (30 mmol/L)，緩慢滴加少量1 mol/L NaOH幫助溶解，pH計(jì)監(jiān)控溶解過(guò)程pH不超過(guò)8.0。緩慢加入HPGM×HCl，攪拌溶解，0.3 mol/L的磷酸鈉緩沖液 (pH 6.2)定容至 96 mL (加入酶溶液后初始反應(yīng)體系約為100 mL)。用1 mol/L NaOH調(diào)整pH至6.0。

催化反應(yīng)：向底物混合物中加入酶液開(kāi)啟反應(yīng)，酶加量為 22 U/(mL反應(yīng)體系)。酶反應(yīng)在36 ℃，pH為(6.0±0.1)的條件下進(jìn)行，以pH自動(dòng)控制器控制pH并自動(dòng)流加1 mol/L NaOH，記錄所加NaOH的體積，用于計(jì)算即時(shí)反應(yīng)體積。取樣初始反應(yīng)混和物，HPLC測(cè)定2種底物的初始濃度。反應(yīng)過(guò)程中間隔取樣，HPLC分析反應(yīng)體系中各組分濃度。

1.3.7 HPLC檢測(cè)條件

去離子水稀釋反應(yīng)體系中取出的樣品，使?jié)舛冉橛诟鹘M分標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)。10 000×g離心后，HPLC分析上清液。分析柱：Ultimate XB-18(200 mm×46 mm，5 μm)。流動(dòng)相：A 相：MeOH；B相：50 mmol/L磷酸銨緩沖液 (pH 2.1)，A∶B=15∶85 (V/V)。B相配置方法：3 mL 85%磷酸溶于950 mL去離子水，25%氨水溶液調(diào)整pH至2.1，去離子水定容至 1 L后混勻備用。流速：1 mL/min，柱溫箱：35 ℃。檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm。

2 結(jié)果

2.1 重組AEH的克隆、純化與鑒定

PCR擴(kuò)增得到與預(yù)期大小一致的條帶 (約2 kb)。經(jīng)回收測(cè)序分析，確定為aeh基因，提交GenBank獲得登錄號(hào)JF744990。

親和層析步驟中，含50 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液可以將絕大部分AEH洗脫下來(lái)。經(jīng)過(guò)超濾離心濃縮后的酶溶液經(jīng)SDS-PAGE分析，重組蛋白單亞基的分子量約為 72 kDa，與報(bào)道的X. rubrillineans AEH的單亞基分子量一致[18](圖 2)。

大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)的重組AEH大約占無(wú)細(xì)胞提取物中總蛋白的1%。經(jīng)過(guò)3個(gè)步驟的提取，從 1 L大腸桿菌的發(fā)酵液中可獲得約1.7 mg 純度為90%的AEH (表1)。

2.2 重組AEH催化合成頭孢曲嗪最適pH和溫度

圖2 經(jīng)純化的重組AEH電泳圖Fig. 2 SDS-PAGE of purified recombinant AEH. M:protein marker; 1: sample of recombinant AEH after affinity chromatography.

表1 大腸桿菌BL21(DE3)中的重組AEH的純化Table 1 Purification of recombinant AEH from E. coli BL21(DE3)

分離自X. rubrillineans的AEH其穩(wěn)定pH范圍介于5.0～8.0[19]。因此將重組AEH催化頭孢曲嗪合成的pH考察范圍定在5.5～7.5。如圖3所示，pH 6.0的緩沖體系中重組AEH催化頭孢曲嗪合成的初速度最高。

考慮到底物溶解度[20]和酶的溫度穩(wěn)定性[21]，將合成反應(yīng)溫度的考察范圍定在28 ℃～40 ℃之間。在 pH為 (6.0±0.1)的條件下，不同溫度下重組AEH合成頭孢曲嗪的反應(yīng)過(guò)程如圖4所示，最適溫度下生成的頭孢曲嗪的量標(biāo)準(zhǔn)化為100%。反應(yīng)初速度隨溫度升高而增加，溫度越高，達(dá)到最高反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的時(shí)間越短。以反應(yīng)轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)，重組AEH頭孢曲嗪合成的最佳溫度為36 ℃。反應(yīng)溫度的選擇需要綜合考慮幾個(gè)方面的因素，溫度不僅影響酶催化的速度，也會(huì)影響反應(yīng)各組分溶解性及反應(yīng)產(chǎn)物的穩(wěn)定性。相對(duì)較低的溫度可以增加酶及產(chǎn)物穩(wěn)定性，但是達(dá)到最高轉(zhuǎn)化率的時(shí)間可能延長(zhǎng)而導(dǎo)致工業(yè)化之后的時(shí)間成本增加。

圖3 pH對(duì)AEH合成頭孢曲嗪初速度的影響Fig. 3 Effect of pH on initial activity of AEH toward cefatrizine synthesis. The initial activity under optimal pH was standardized to 100%. All synthesis experiments were performed in triplicate by purified enzyme.

圖4 溫度對(duì)AEH合成頭孢曲嗪初速度的影響Fig. 4 Effect of temperature on initial activity of AEH toward cefatrizine synthesis. The initial activity under optimal temperature was standardized to 100%. All synthesis experiments were performed in triplicate by purified enzyme.

2.3 兩底物不同摩爾比條件下頭孢曲嗪的合成

反應(yīng)溫度36 ℃，反應(yīng)pH為 (6.0±0.1)的條件下，當(dāng)母核7-ATTC的濃度約為30 mmol/L，側(cè)鏈HPGM×HCl與母核初始摩爾比分別為2.0、2.9和4.1時(shí)，頭孢曲嗪的酶法合成實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。合成轉(zhuǎn)化率ηCFTZ隨著摩爾比的增加而增加。

側(cè)鏈與母核摩爾比為4.1的條件下，整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中底物的減少以及產(chǎn)物的增加見(jiàn)圖5。轉(zhuǎn)化率在150 min到達(dá)峰值，后續(xù)90 min內(nèi)，頭孢曲嗪的濃度基本不變。從工業(yè)角度看該現(xiàn)象非常有利，有足夠的時(shí)間終止酶催化反應(yīng)以及進(jìn)行下游過(guò)程處理，不必?fù)?dān)心產(chǎn)物的水解。合成轉(zhuǎn)化率最高處，HPGM大約剩余40%，此后的HPGM沒(méi)有用于合成頭孢曲嗪，而是緩慢水解為HPG。

圖5也顯示了相對(duì)于母核和側(cè)鏈濃度的物質(zhì)平衡情況。整個(gè)催化反應(yīng)過(guò)程中，含HPG化合物 (HPG+HPGM+頭孢曲嗪)的物質(zhì)平衡非常好，介于 97%～101%之間，含母核化合物(7-ATTC+頭孢曲嗪)的物質(zhì)平衡隨著反應(yīng)的進(jìn)行逐漸下降，在最高轉(zhuǎn)化率處，即150 min時(shí)為89.9%，至反應(yīng)終止時(shí)為81.7%。

表2 重組AEH催化7-ATTC和HPGM合成頭孢曲嗪Table 2 Enzymatic synthesis of cefatrizine from 7-ATTC and HPGM by AEH

圖5 AEH催化的頭孢曲嗪合成動(dòng)態(tài)過(guò)程Fig. 5 Dynamics of cefatrizine synthesis by AEH.Initial masses of 7-ATTC and HPGM were standardized to 100%.

3 討論

由于實(shí)驗(yàn)是產(chǎn)業(yè)化工藝的前期研究，為了保障工藝規(guī)模放大后的重現(xiàn)性，每一次頭孢曲嗪酶法合成實(shí)驗(yàn)都采用 HPLC精確測(cè)定底物初始濃度，避免了通過(guò)稱量和定容引起的誤差。反應(yīng)過(guò)程定量調(diào)節(jié)pH導(dǎo)致的反應(yīng)體積增加，保證對(duì)最高轉(zhuǎn)化率時(shí)間點(diǎn)處各組分的精確定量。

母核物質(zhì)平衡在整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中呈現(xiàn)逐步下降的趨勢(shì)，可能與母核7-ATTC的某種副反應(yīng)有關(guān)。在所有反應(yīng)混合物樣品的HPLC圖譜中出現(xiàn)了與4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品不一致的2個(gè)未知的峰 (結(jié)果未顯示)?？梢源_定的是該副反應(yīng)與酶相關(guān)，因?yàn)橐跃彌_液代替酶液的反應(yīng)空白對(duì)照并沒(méi)出現(xiàn)未知峰，具體是何物質(zhì)有待進(jìn)行收集和解析，以探索排除該副反應(yīng)的可能性。

雖然形成頭孢曲嗪需要的?；荏w (母核7-ATTC)和供體 (HPGM)的摩爾比相等，由于HPGM存在水解副反應(yīng)，HPGM的過(guò)量可以提高產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率。這也是通過(guò)動(dòng)力學(xué)控制使反應(yīng)向合成方向進(jìn)行的體現(xiàn)。頭孢氨芐、頭孢唑啉和頭孢克洛也有采用該策略的報(bào)道[22]。雖然側(cè)鏈成本低于母核，但顯然無(wú)限制升高側(cè)鏈濃度并不是提高轉(zhuǎn)化率的明智選擇。因此實(shí)驗(yàn)選擇的摩爾比范圍介于2∶1～4∶1。下一步將在此基礎(chǔ)上嘗試添加有機(jī)溶劑抑制水解或采用產(chǎn)物絡(luò)合的方法提高合成轉(zhuǎn)化率。

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)一方面實(shí)現(xiàn)了 AEH的異源表達(dá)，為降低酶的生產(chǎn)成本提供了可能；另一方面，確定了反應(yīng)體系中各成分的 HPLC分析方法和物質(zhì)量衡算方法。不過(guò)，頭孢曲嗪64.3%的轉(zhuǎn)化率距離實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化還有很長(zhǎng)的路要走，可以選擇很多策略來(lái)改善轉(zhuǎn)化率，比如：通過(guò)分子改造[23]或酶制劑形式[24]提高催化合成頭孢曲嗪的效率，或通過(guò)改變反應(yīng)體系使反應(yīng)平衡傾向合成反應(yīng)[25]等等。

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