大腸桿菌細(xì)胞抽提物制備方案的簡化與優(yōu)化

郭新娟，權(quán)春善，趙朋超，王麗娜，范圣第

1 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，遼寧 大連 1160232 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 1000493 大連民族學(xué)院生物技術(shù)與資源利用國家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116600

大腸桿菌細(xì)胞抽提物制備方案的簡化與優(yōu)化

郭新娟1,2，權(quán)春善3，趙朋超1,2，王麗娜1,2，范圣第3

1 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，遼寧 大連 116023
2 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049
3 大連民族學(xué)院生物技術(shù)與資源利用國家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116600

郭新娟, 權(quán)春善, 趙朋超, 等. 大腸桿菌細(xì)胞抽提物制備方案的簡化與優(yōu)化. 生物工程學(xué)報(bào), 2013, 29(4): 532?535.

XJ Guo, Quan CS, Zhao PC, et al. Simplification and optimization of the preparation ofEscherichia coliextract for cell-free protein expression. Chin J Biotech, 2013, 29(4): 532?535.

無細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)是一種將目的蛋白在體外進(jìn)行表達(dá)的新技術(shù)和新方法，已廣泛應(yīng)用到蛋白質(zhì)組學(xué)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能等領(lǐng)域的研究中。在無細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)中，細(xì)胞抽提物的制備是關(guān)鍵因素之一。通過對(duì)大腸桿菌細(xì)胞抽提物制備過程中離心速度、預(yù)孵化和透析等參數(shù)的考察，利用綠色熒光蛋白作為報(bào)告蛋白，可以得到一個(gè)細(xì)胞抽提物制備的簡化方案。采用相對(duì)低的轉(zhuǎn)速 (12 000×g，10 min)，簡易空孵化即可制備出活性高的細(xì)胞抽提物，用于無細(xì)胞體系蛋白表達(dá)，其表達(dá)的綠色熒光蛋白產(chǎn)量為209 μg/mL。與傳統(tǒng)的大腸桿菌細(xì)胞抽提物S30相比較，新方案將使時(shí)間與成本節(jié)省62%，產(chǎn)量是傳統(tǒng)方法的2.6倍，使無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)的操作快速、高通量的優(yōu)勢(shì)更加明顯。

蛋白質(zhì)表達(dá)，無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，細(xì)胞抽提物，大腸桿菌，體外表達(dá)

表達(dá)蛋白的傳統(tǒng)方法是采用重組載體,在宿主菌體內(nèi)表達(dá)，這種方式有諸多缺點(diǎn)：表達(dá)量低、細(xì)胞毒性大、易形成包涵體等[1]。利用無細(xì)胞系統(tǒng)體外表達(dá)蛋白，克服了上述缺點(diǎn)，具有操作快速、高通量、表達(dá)量高和不形成包涵體等優(yōu)點(diǎn)[2-4]。無細(xì)胞系統(tǒng)體外表達(dá)蛋白[5]，可根據(jù)具體需要，介入對(duì)表達(dá)條件的調(diào)控和修飾，如加入脂質(zhì)、表面活性劑等物質(zhì)[6]。細(xì)胞抽提物是無細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)中的一個(gè)重要組分，其活性高低直接影響目的蛋白的產(chǎn)量。細(xì)胞抽提物的制備成本高、步驟繁瑣，傳統(tǒng)的制備方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力。盡管如此，對(duì)于無細(xì)胞體系，大部分研究主要集中在提高蛋白產(chǎn)率[7-10]，延長反應(yīng)時(shí)間[11-12]等方面，對(duì)于細(xì)胞抽提物制備方法的研究較少。

大腸桿菌細(xì)胞抽提物的傳統(tǒng)制備方法是 1984年由Pratt[13]建立的，稱之為S30抽提物，是目前絕大多數(shù)研究者所采用的方法。Swartz等[14]研究簡化了S30制備的步驟，但依舊較繁瑣。Kim等[15]采用無細(xì)胞體系表達(dá)氯霉素氨酰轉(zhuǎn)移酶，簡化了抽提物的制備。本文在前人[5,14-15]的研究基礎(chǔ)上，致力于研究簡單高效的抽提物制備方法，即采用大腸桿菌BL21 (DE3) Codon-Plus RIL菌株，考察不同制備方法對(duì)綠色熒光蛋白 (Green fluorescent protein，GFP)表達(dá)的影響，得到一個(gè)簡化方案：采用相對(duì)低的離心速度 (12 000×g，10 min) 和簡易空孵化即可制備出活性高的細(xì)胞抽提物，其表達(dá)的 GFP產(chǎn)量為209 μg/mL。與傳統(tǒng)S30相比，新方案節(jié)省了62%的時(shí)間與成本，并使GFP產(chǎn)量提高至2.6倍。

1 材料與方法

1.1 材料

質(zhì)粒pET28a (+)-GFP用作無細(xì)胞體系的模板。E. coliBL21 (DE3) Codon-Plus RIL菌株用于細(xì)胞抽提物的制備。透析管 (MWCO=15K) 購自Spectrum公司；培養(yǎng)基、三羥甲基氨基甲烷 (Tris(hydroxymethyl) aminomethane，Tris)，乙酸和乙酸鉀購自生工生物工程 (上海) 股份有限公司；磷酸烯醇式丙酮酸和磷酸激酶購自羅氏公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購自 Qiagen公司；其他試劑購自 SIGMAALDRICH公司。

S30緩沖液 A/B：10 mmol/L Tris-乙酸(pH 8.2)，14 mmol/L乙酸鎂，60 mmol/L乙酸鉀，1 mmol/L二硫蘇糖醇，0.5 mL/L 2-巰基乙醇 (僅緩沖液A中含有)。

預(yù)孵化緩沖液：293 mmol/L Tris-乙酸(pH 8.2)，9.2 mmol/L乙酸鎂，13.2 mmol/L腺嘌呤核苷三磷酸 (pH 7.0)，84 mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸 (pH 7.0)，4.4 mmol/L二硫蘇糖醇，20種氨基酸均40 mmol/L，6.7 U/mL磷酸激酶。

1.2 方法

1.2.1 大腸桿菌細(xì)胞抽提物的制備

本實(shí)驗(yàn)采用 5種流程制備大腸桿菌細(xì)胞抽提物，分別是：標(biāo)準(zhǔn)S30、較簡S30、S12、較簡S12和最簡S12抽提物。

標(biāo)準(zhǔn)S30抽提物的制備參照Pratt[13]的方法。將種子液接到2×YT培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)。待OD600達(dá)到 0.6，加入異丙基硫代半乳糖苷 (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)。OD600≈3 時(shí)，離心收菌。將每克濕菌體用20 mL S30緩沖液A在4 ℃下沖洗3次，在液氮中浸2 min后保存于?70 ℃，1～3 d。將細(xì)胞用S30緩沖液A解凍重懸，4 ℃下離心收集，每克菌體重懸于1.27 mL的S30緩沖液B中。130 MPa的壓強(qiáng)下，高壓破碎菌體3次。立即離心2次 (4 ℃，30 000×g，30 min)，取上清。加入0.3倍體積的預(yù)孵化緩沖液，37 ℃孵育80 min。之后將粗提物裝入透析管中，每7 g濕菌在750 mL S30緩沖液B中4 ℃下透析4次，每次45 min。4 ℃、4 000×g離心10 min，吸取上清，分裝至離心管中，在液氮中浸2 min，貯存于?70 ℃。較簡S30抽提物的制備參照 Swartz等[14]的方法，與標(biāo)準(zhǔn) S30相比不同之處是：空孵化并縮短透析時(shí)間 (上清37 ℃下孵育80 min，粗提物透析40 min)。S12抽提物的制備與標(biāo)準(zhǔn) S30相比不同之處是：收集的菌體用S30緩沖液A重懸1次，浸液氮后保存，之后將細(xì)胞在S30緩沖液B中解凍重懸便破碎，離心1次(4 ℃，12 000×g，10 min)。較簡 S12抽提物的制備與S12相比不同之處是：空孵化并簡易透析 (37 ℃孵育80 min，粗提物透析40 min)。最簡S12抽提物的制備與較簡S12相比不同之處是：簡易空孵化，即上清孵育30 min便分裝貯存。

1.2.2 無細(xì)胞體系蛋白表達(dá)

無細(xì)胞體系采用批量式，在1.5 mL離心管中，30 ℃、180 r/min反應(yīng)4 h。60 μL的反應(yīng)體系在Kigawa等[16]的基礎(chǔ)上作了修改：10.7 mmol/L乙酸鎂，2.5 μg/mL肌酸激酶，20 μg/mL模板pET28a(+)-GFP，1 mmol/L IPTG，24% (V/V) 細(xì)胞抽提物。采用5種細(xì)胞抽提物分別進(jìn)行無細(xì)胞蛋白表達(dá)，同種抽提物的體系分2組：加入和未加模板，共10組反應(yīng)體系。

1.2.3 無細(xì)胞體系反應(yīng)產(chǎn)物的分析

無細(xì)胞體系的反應(yīng)物經(jīng)丙酮沉淀后用聚丙烯酰胺凝膠電泳 (Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE) 上樣緩沖液溶解，37 ℃水浴5 min。上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后將凝膠置于紫外下觀測(cè)熒光，隨后采用考馬斯亮藍(lán)染色。

GFP蛋白帶有His標(biāo)簽，因此可進(jìn)行Western blotting檢測(cè)：將電泳后的凝膠轉(zhuǎn)到膜上，經(jīng)過封閉和抗體孵育，最后顯色。

采用熒光分析儀測(cè)量反應(yīng)后體系的熒光強(qiáng)度來得到GFP蛋白的表達(dá)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同細(xì)胞抽提物對(duì)GFP表達(dá)量的影響

由 SDS-PAGE電泳 (圖未顯示)和 Western blotting檢測(cè) (圖1) 可知，10組抽提物的無細(xì)胞體系中，加入模板的體系均有 GFP蛋白表達(dá)，未加模板的體系均無表達(dá)。采用蛋白凝膠電泳分析軟件，結(jié)合蛋白標(biāo)準(zhǔn)的上樣量，得到“最簡S12抽提物”的表達(dá)水平為209 μg/mL。

將電泳凝膠在染色前置于紫外下觀測(cè)熒光(圖未顯示)：只有9號(hào)體系能明顯觀察到熒光。這表明“最簡S12抽提物”活性最好，其反應(yīng)體系的GFP表達(dá)量最高。2、4、6、8、10體系未加模板，無GFP表達(dá)，故未見熒光。1、3、5、7號(hào)體系由于GFP表達(dá)量較少，故不能明顯觀察到熒光。

圖1 GFP蛋白的Western blotting檢測(cè)圖Fig. 1 Western blotting analysis of GFP expressed in cell-free systems with different cell extracts. Cell-free systems containing different cell extracts with (+), or without (?) DNA template. 1, 2: standard S30 extract; 3,4: the simpler S30 extract; 5, 6: S12 extract; 7, 8: the simpler S12 extract; 9, 10: the simplest S12 extract.

利用熒光分析儀測(cè)量反應(yīng)后體系的熒光強(qiáng)度得到無細(xì)胞體系的相對(duì)熒光強(qiáng)度 (圖2)。由結(jié)果可見抽提物的產(chǎn)量由大到小順序是：最簡S12＞較簡S30＞較簡S12＞標(biāo)準(zhǔn)S30>S12。

2.2 細(xì)胞抽提物的不同制備方法對(duì)工作量的影響

我們分析了不同制備方法消耗時(shí)間的差別：標(biāo)準(zhǔn)S30耗時(shí)最多，約11 h；最簡S12流程最簡單快速，耗時(shí)約4 h，相比標(biāo)準(zhǔn)S30，節(jié)省了62%的時(shí)間和成本，產(chǎn)量也提高到2.6倍，尤其適合于自動(dòng)化和高通量的蛋白質(zhì)組學(xué)等領(lǐng)域。

圖2 不同無細(xì)胞體系中GFP的表達(dá)量柱狀圖Fig. 2 Production yield of GFP synthesized in different cell-free systems. A: the standard S30 extract; B: the simpler S30 extract; C: S12 extract; D: the simpler S12 extract; E: the simplest S12 extract.

強(qiáng)化細(xì)胞抽提物效率是提高無細(xì)胞蛋白表達(dá)體系產(chǎn)量的一個(gè)關(guān)鍵和重要因素。本研究將為無細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。S12比S30的表達(dá)量高，可能是因?yàn)橄鄬?duì)低的離心速度保留了較多的功能蛋白，有利于無細(xì)胞體系蛋白的表達(dá)。至于不同離心轉(zhuǎn)速、預(yù)孵化和透析改變了什么，不同細(xì)胞抽提物的活性物質(zhì)含量的差別等，還有待進(jìn)一步深入研究。

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November 16, 2012; Accepted: January 14, 2013

Chunshan Quan. Tel: +86-411-87656219; Fax: +86-411-87644496; E-mail: mikyeken@dlnu.edu.cn

Simplification and optimization of the preparation ofEscherichia coliextract for cell-free protein expression

Xinjuan Guo1,2, Chunshan Quan3, Pengchao Zhao1,2, Lina Wang1,2, and Shengdi Fan3

1Dalian Institute of Chemical Physics,Chinese Academy of Sciences,Dalian116023,Liaoning,China
2University of Chinese Academy of Sciences,Beijing100049,China
3Key Laboratory of Biotechnology and Resource Utilization,State Ethnic Affairs Commission and Ministry of Education,Dalian Nationalities University,Dalian116600,Liaoning,China

Cell-free protein expression system is a new method to express target proteinin vitroand has been widely applied to the study of protein structure, protein function and other related fields. Preparation of cell extract is one of the key factors that affect the efficiency of the cell-free system. To improve the efficiency and economical feasibility of cell-free protein synthesis, we discussed the parameters during the preparation of the cell extract. These parameters include centrifugation speed, pre-incubation, and dialysis. We used the green fluorescent protein as the reporter protein, and obtained a simple procedure for the preparation ofEscherichia colicell extract. A simple centrifugation step (12 000×g,10 min) followed by a brief incubation was sufficient for the preparation of an active cell extract to support protein expression with higher productivity (209 μg/mL). Compared to the traditionalE. coliS30 procedure, the processing time was reduced by 62%, and the productivity was increased by 2.6 times. The new procedure will make the advantage of cell-free technology more obvious, and promote its wider application.

protein synthesis, cell-free expression system, cell extract,Escherichia coli, in vitro

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 21152002), the Fundamental Research Funds for the Central Universities(No. DC12010118).

國家自然科學(xué)基金 (No. 21152002)，中央高校專項(xiàng)基金 (No. DC12010118) 資助。

時(shí)間：2013-01-17 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20130117.1629.001.html

(本文責(zé)編 陳宏宇)