阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶的原核表達及其多克隆抗體制備

徐曉可，吳清平，張淑紅，張菊梅，李程思，郭偉鵬

（廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點實驗室，廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實驗室，廣東省華南應(yīng)用微生物重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，廣東省微生物研究所，廣東廣州510070）

阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）是奶制品中備受關(guān)注的一種致病菌[1-3]，F(xiàn)AO/WHO將阪崎腸桿菌列為嬰兒配方奶粉中的A類致病菌。由于阪崎腸桿菌在奶粉中的污染水平很低，而且奶粉不是無菌產(chǎn)品，可能會存在各種雜菌的污染，因此在檢測阪崎腸桿菌時會有其他菌的干擾或者競爭，免疫磁珠分離技術(shù)會在一定程度上解決這個問題。免疫磁珠能特異性吸附目的細菌，可有效地富集大量樣品中的少量病原菌，為解決環(huán)境及食品中細菌富集問題提供了一種有效手段，在食品微生物檢測領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[4-6]。免疫磁珠分離方法的特異性與所用的抗體密切相關(guān)，抗體制備是免疫磁珠的基礎(chǔ)。本研究的目的是克隆和原核表達阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶基因malA，獲得阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶融合蛋白，制備特異性好的兔抗α－葡萄糖苷酶的多克隆抗體以用于研制免疫磁珠。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

阪崎腸桿菌ATCC 29544、大腸桿菌DH5α、表達質(zhì)粒pET22b（+）由本實驗室保存；pMD 19－T Simple Vector 購自TaKaRa公司；大腸桿菌BL21（DE3）購自TIANGEN公司；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ、T4 DNA連接酶 購自TaKaRa公司；DNA聚合酶（Dream TaqTM Green PCR Master Mix（2×））、DNA marker、蛋白marker 購自Fermentas公司；PCR產(chǎn)物回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒 購自上海生工生物工程有限公司；弗氏佐劑和弗氏不完全佐劑 購自Sigma公司；其他試劑 國產(chǎn)分析純；實驗用的各種培養(yǎng)基 均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；新西蘭大白兔 購自中山醫(yī)科大學(xué)試驗動物中心。

PCR儀 美國BIO－RAD公司；凝膠分析成像系統(tǒng) 美國GE公司；微量離心機 德國Ependorf公司；熒光顯微鏡 德國LEICA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 參考Genebank公布的序列，設(shè)計正反向引物，由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列為

ESF：5’－TTTGGATCCGATGAGTGAAGCACCGA CGCAG－3’；

ESR：5’－GGCGAAGCTTCGACGTCAGTTTATAA ACCCG－3’。引物ESF和ESR下劃線序列分別表示BamHⅠ和HindⅢ酶切位點。

1.2.2 malA基因的PCR擴增及克隆 以阪崎腸桿菌ATCC29544基因組DNA為模板進行PCR擴增，體系為50μL，Dream TaqTMGreen PCR Master Mix（2×）25μL，引物ESF和ESR各2μL，DNA模板2μL，ddH2O 19μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃ 5min；94℃ 30s，58℃ 45s，72℃1min，35個循環(huán)；72℃ 7min?；厥誔CR產(chǎn)物，與pMD19－T Simple Vector連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，利用上海生工生物工程有限公司的UNIQ－10柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒抽提質(zhì)粒，進行BamHⅠ/HindⅢ雙酶切鑒定及測序鑒定。

1.2.3 表達載體的構(gòu)建 將上述鑒定正確的重組質(zhì)粒和pET22b（+）質(zhì)粒載體用BamHⅠ、HindⅢ雙酶切，將純化的DNA片段與線性化的pET22b（+）載體連接，熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞。提取質(zhì)粒、PCR及酶切鑒定。

1.2.4 蛋白的誘導(dǎo)表達及純化 挑選陽性菌株和對照菌株的單菌落，接種于5mL含有100μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃ 200r/min培養(yǎng)至OD600為0.6時，分別加入終濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/L的IPTG誘導(dǎo)3、4、5h，將誘導(dǎo)產(chǎn)物進行SDS－PAGE檢測，確定最佳IPTG誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時間。

按上述所確定的最佳參數(shù)誘導(dǎo)表達重組蛋白，將收集到的誘導(dǎo)菌液超聲至澄清透亮，收集包涵體；用6mol/L的尿素洗滌包涵體進行SDS－PAGE蛋白分離；膠上割取目的帶，加入適量的PBS溶液進行搗碎，置4℃緩慢攪拌過夜；離心12000r/min 5min，收集上清液，并裝入透析袋，用PEG－20000濃縮，置－80℃冰箱保存。

1.2.5 多克隆抗體制備及鑒定 新西蘭大白兔（雌雄各一只，13周兔齡，體重為2.4kg）適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，初免取1mg/只純化蛋白用Sigma完全佐劑充分乳化，背部皮下多點注射；初免2周后加強免疫4次，每次間隔1周，前3次免疫劑量為0.5mg/只，蛋白用Sigma不完全佐劑乳化，背部皮下多點注射；末次加強免疫劑量為2mg/只，耳緣靜脈注射，3d后取血。在免疫前采5mL陰性血液，用于陰性血清檢測用。間接ELISA方法測定抗血清效價。

免疫熒光法鑒定與阪崎腸桿菌表面結(jié)合能力：首先，將一定濃度阪崎腸桿菌菌液100μL滴加至載玻片上，在超凈臺中自然風(fēng)干，然后滴加抗血清100μL，37℃孵育lh；用PBST洗滌載玻片3次，用FITC標記的羊抗兔IgG（1∶100）37℃孵育lh；PBST洗滌4次，然后在熒光顯微鏡下觀察阪崎腸桿菌菌體的發(fā)光情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 malA基因的克隆及鑒定

圖1 malA基因的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification product

圖2 pMD19－malA的PCR鑒定Fig.2 PCR identification of recombinant plasmid pMD19－malA

圖3 pMD19－malA的酶切鑒定Fig.3 Identification of recombinant plasmid pMD19－malA

利用設(shè)計的引物擴增出約1600bp左右的目的基因片段，與malA基因預(yù)期大小相符（圖1）。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定可以擴增出1600bp左右片段（圖2），證實malA基因已成功克隆到T載體。用BamHⅠ、HindⅢ進行雙酶切亦獲得1600bp左右的片段（圖3）。經(jīng)測序鑒定，malA基因全長1677bp，其序列與Genebank的序列具有100%的同源性。

2.2 malA基因表達質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

重組表達質(zhì)粒pET22b－malA雙酶切的電泳結(jié)果如圖4所示，在約1600bp處出現(xiàn)目的條帶（與預(yù)期相符），說明目的基因成功插入表達載體pET22b中。

圖4 pET22b－malA的酶切鑒定Fig.4 Identification of recombinant plasmid pET22b－malA

2.3 蛋白誘導(dǎo)表達及純化

SDS－PAGE結(jié)果（圖5）表明，其最優(yōu)化的表達條件是37℃下用0.8mmol/L IPTG誘導(dǎo)5h。重組蛋白以包涵體形式存在（圖6）。切膠純化的目的蛋白分子量約為67ku（圖7）。

圖5 SDS－PAGE分析不同IPTG濃度和不同誘導(dǎo)時間對蛋白表達的影響Fig.5 SDS－PAGE analysis of protein expression with different IPTG concentration and different induction time

圖6 融合蛋白的可溶性分析Fig.6 Soluble analysis of fusion protein

圖7 融合蛋白切膠純化電泳圖Fig.7 SDS－PAGE analysis of fusion

2.4 多克隆抗體效價

用間接ELISA檢測其效價約為5×105（圖8）。

圖8 多克隆抗體效價曲線Fig.8 Titer cure of polyclonal antibody

2.5 多克隆抗體與阪崎腸桿菌菌體的結(jié)合

熒光顯微鏡觀察的結(jié)果顯示多抗能與阪崎腸桿菌菌體有較好的特異性結(jié)合（圖9）。

圖9 多抗與阪崎腸桿菌菌體結(jié)合Fig.9 Combination of the polyclonal antibody and E.sakazakii

3 討論

由于阪崎腸桿菌是條件致病菌，只是對免疫力低下的人群造成危害，雖有報道對成年人也有影響，但危害較小，所以一直以來并未對食品中阪崎腸桿菌進行檢測控制。但是自從阪崎腸桿菌造成的危害頻頻報道后，食品中特別是嬰幼兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的檢測就顯得非常重要[7]。目前國內(nèi)外已建立了多個檢測標準，包括國際標準化組織ISO標準、美國FDA標準、中國國家標準GB和行業(yè)SN標準，這些標準主要還是沿用傳統(tǒng)的檢測方法，檢測周期比較長。近年來國內(nèi)外還發(fā)展了針對阪崎腸桿菌的分子生物學(xué)檢測方法[8－12]。上述方法都涉及樣品前處理，其中免疫磁珠分離技術(shù)是樣品前處理的有效手段，但目前市場上沒有針對阪崎腸桿菌的多克隆抗體和單克隆抗體，所以制備抗體對免疫磁珠方法的建立十分必要。

阪崎腸桿菌的α-葡萄糖苷酶活性是區(qū)別于腸桿菌科其他細菌的一個重要特征，在文獻報道的所有樣品分離株中均呈現(xiàn)為陽性，α-葡萄糖苷酶活性能夠分解p-nitrophenyl-alpha-D-glucoside底物，呈現(xiàn)藍綠色[13]，這也是采用傳統(tǒng)生化培養(yǎng)法檢測阪崎腸桿菌的關(guān)鍵性步驟。根據(jù)Genebank該基因的序列分析可知，其表達產(chǎn)物為跨膜蛋白，這與楊捷琳等[14]的實驗結(jié)果一致。因此，它可以做為檢測阪崎腸桿菌的一個很好的靶點。在抗原設(shè)計上采用α-葡萄糖苷酶基因malA的全長，插入到pET-22b（+）原核表達載體中。由于該載體為高表達載體，融合蛋白的表達量很高，表達的蛋白質(zhì)以不溶性包涵體形式存在。因此，本研究采用包涵體作為抗原，利用割膠回收的融合蛋白制備多克隆抗體，結(jié)果證明這種方法在制備多克隆抗體時是可行的，且方法操作簡便。為探討該多抗能與阪崎腸桿菌表面結(jié)合，在多抗與阪崎腸桿菌孵育1h后，使用FITC標記的羊抗兔二抗處理，然后在熒光顯微鏡下觀察阪崎腸桿菌菌體的發(fā)光情況。結(jié)果顯示，多克隆抗體能與阪崎腸桿菌表面結(jié)合。多克隆抗體的制備成功為進一步研制免疫磁珠提供了重要工具，為快速靈敏檢測阪崎腸桿菌奠定基礎(chǔ)。

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