發(fā)酵梨酒中產(chǎn)香酵母的分離、鑒定及生物學(xué)特性的研究

張大為，張 潔，洪磊東，張 丹，高 健，梁 芳

（1.湖南科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖南湘潭 411201；2.陜西科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710021）

梨屬于薔薇科植物，果實(shí)味道鮮美，含有多種維生素、微量元素及人體所需必需氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)，具有生津止渴、潤肺止咳的作用，是人們喜愛的常見水果之一。近年來，由于梨樹種植技術(shù)的大力推廣及國家對(duì)水果行業(yè)的重視，梨的種植面積及產(chǎn)量逐年增加。梨成為僅次于蘋果和柑橘的第三大水果，產(chǎn)量居世界第一位。我國梨主要分布在陜西、山東、河北、遼寧、安徽等地，成為很多地方的支柱產(chǎn)業(yè)之一[1]。由于梨主要以鮮食為主，加工技術(shù)相對(duì)落后，所以總體上來說是處于供過于求的局面，但是消費(fèi)者平均占有量還不及世界平均水平的一半，主要原因在于還沒有從根本上解決水果行業(yè)發(fā)展的主要矛盾，即供求關(guān)系。開發(fā)梨酒是解決供求關(guān)系的一種行之有效的方法，同時(shí)也響應(yīng)了我國關(guān)于酒業(yè)發(fā)展的指導(dǎo)思想，即以果酒逐步取代一部分糧食白酒的戰(zhàn)略構(gòu)想[2]。酒的風(fēng)味主要取決于酵母的性質(zhì)，除釀酒酵母外，非釀酒酵母也在果酒釀造中起到了很重要的作用[3]。以前非釀酒酵母被認(rèn)為是引起果酒腐敗的微生物，但近年來的研究證實(shí)了某些非釀酒酵母對(duì)酒的品質(zhì)是有積極貢獻(xiàn)的，尤其是產(chǎn)香酵母對(duì)果酒中醇類、酯類物質(zhì)的生成起著重要的作用，可賦予果酒濃郁的發(fā)酵香，與產(chǎn)酒率高的果酒酵母混合發(fā)酵可得到風(fēng)味更佳的果酒[4－7]。本實(shí)驗(yàn)從自然發(fā)酵的梨酒中分離得到的一株產(chǎn)香酵母，其產(chǎn)香濃郁，能在梨酒發(fā)酵中起到增香的作用。該菌種和本研究前期報(bào)道的釀酒酵母YDJ05配合使用，能起到增香的作用，也為利用YDJ05和該菌種進(jìn)行原生質(zhì)體融合來選育能夠產(chǎn)香的釀酒酵母奠定基礎(chǔ)[8]。本研究對(duì)該菌種的生物學(xué)特性進(jìn)行了詳細(xì)的研究，并通過分子生物學(xué)手段鑒定到種，為后期進(jìn)一步研究和在梨酒中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酥梨 陜西蒲城；麥芽汁培養(yǎng)基 陜西藍(lán)馬啤酒有限公司；自然發(fā)酵梨酒 將采集成熟的梨，制備梨汁，調(diào)整糖度15°Brix，經(jīng)28℃自然發(fā)酵9d；發(fā)酵培養(yǎng)基 上述制得糖度為15°Bé的梨汁，115℃、20min滅菌備用；DNA凝膠回收試劑盒 購自O(shè)mega公司；其他如Tap酶、dNTPs等分子生物學(xué)試劑 由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司提供。

BSP－400型生化培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；SW－CJ－2F型超凈工作臺(tái) 蘇州蘇潔凈化設(shè)備廠；AUY－120型分析天平 日本島津公司；PB－10型pH計(jì) 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；YXQ－LS－75SII型立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SZX10攝影顯微鏡 日本OLYMPUS；MASTER－M型手持折光儀 日本ATGO；PTC200型PCR儀 美國BIO－RAD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酵母菌的分離 取1mL自然發(fā)酵的梨酒，進(jìn)行5個(gè)不同梯度的稀釋（10－1～10－5），制成菌懸液，涂布固體麥芽汁培養(yǎng)基平板，每個(gè)稀釋梯度涂布3個(gè)平板，經(jīng)28℃培養(yǎng)2～3d。根據(jù)酵母的菌落及細(xì)胞特征（采用光學(xué)顯微鏡鏡檢），初步分離酵母菌并得到單菌落，保存至斜面培養(yǎng)基，編號(hào)并放入4℃冰箱中保存，備用。

1.2.2 酵母菌的篩選 將上述斜面培養(yǎng)基中的酵母菌接入20mL發(fā)酵培養(yǎng)基的100mL三角瓶中，28℃培養(yǎng)2～3d后利用感官評(píng)定法選出產(chǎn)香濃郁且風(fēng)味柔和的產(chǎn)香酵母菌，按GB/T 15038－2006測(cè)定發(fā)酵液的總酯、酒精含量、還原糖、總酸，再進(jìn)行感官評(píng)定，篩選入選菌種。

1.2.3 入選產(chǎn)香酵母生物學(xué)特性的研究 包括產(chǎn)香酵母的細(xì)胞形態(tài)、生長曲線、最適培養(yǎng)溫度、最適pH、發(fā)酵過程中總酯的變化情況及耐受酒精的濃度。

1.2.3.1 細(xì)胞形態(tài)和生長曲線測(cè)定 將產(chǎn)香酵母菌按照10%接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，定期測(cè)定培養(yǎng)液的OD值（660nm），以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線，同時(shí)制作菌株的水浸片，在光學(xué)顯微鏡下獲得顯微鏡照片（×40）。

1.2.3.2 最適培養(yǎng)溫度的確定 將酵母種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別在20～34℃不同溫度下恒溫培養(yǎng)18h，在660nm下測(cè)定發(fā)酵液OD值，依照OD值大小確定其最適生長溫度。

1.2.3.3 最適pH的確定 選取pH范圍為3.5～5.9，其余同上。

1.2.3.4 總酯的變化情況 酵母的培養(yǎng)條件同上，每隔1d測(cè)定其產(chǎn)酯量。

1.2.4 產(chǎn)香酵母菌的分子生物學(xué)鑒定 26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析。

1.2.4.1 DNA的提取 離心收集5mL菌體，用pH8.0的TE緩沖液洗滌三次，棄上清液，沉淀備用。

1.2.4.2 26S rDNA D1/D2區(qū)的PCR擴(kuò)增及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化、測(cè)序[9]PCR擴(kuò)增采用通用引物對(duì)ITS1（5’－GTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTG－3’）和TS4（5’－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3’）。PCR反應(yīng)體系（50μL）：10×PCR緩沖液，5.0μL；Mg2+（5mmol/L），3.0μL；dNTP（各5mmol/L），2.0μL；引物（20μmol/L）各1.0μL；Taq DNA聚合酶（1U/μL，MBI），1.0μL；模板2.0μL約20ng；去離子水35μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃，30s；52℃，30s：72℃，40s；30個(gè)循環(huán)后72℃ 8min。取5μL產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠電泳并在紫外燈下觀察結(jié)果。

1.2.4.3 系統(tǒng)發(fā)育樹分析[9]運(yùn)用BLAST軟件在GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源序列搜索，根據(jù)同源序列搜索結(jié)果下載相關(guān)菌種的D1/D2區(qū)域序列，與供試菌株序列放在一起，用MEGA4.1軟件進(jìn)行匹配排列，采用鄰接法進(jìn)行系統(tǒng)樹的構(gòu)建，并用BOOTSTRAP程序進(jìn)行1000次可信度分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌的分離

按照1.2.1中的分離方法經(jīng)過感官評(píng)定并配合顯微鏡鏡檢，分離得到46株具有產(chǎn)香能力的酵母其基本特征如表1所示。

表1 酵母的分離結(jié)果Table 1 Separation result of yeast

從分離結(jié)果來看，所得到的酵母特征與文獻(xiàn)報(bào)道的果酒酵母特征相類似，具有典型性[3－7]。通過初步感官評(píng)定，生長菌落的培養(yǎng)基平板能夠產(chǎn)生香氣，是進(jìn)一步篩選的前提條件。

2.2 產(chǎn)香酵母的篩選結(jié)果

通過感官評(píng)定法在上述酵母菌中得到4株產(chǎn)香濃郁且風(fēng)味柔和的產(chǎn)香酵母分別命名為YS01～YS04，其產(chǎn)酯、酒精等指標(biāo)如表2所示。

表2 各菌株第5d發(fā)酵結(jié)果Table 2 The fifth day fermentation results of the strains

從表2可以看出，產(chǎn)香濃郁且風(fēng)味柔和的酵母中，YS03的產(chǎn)酯量最高，達(dá)到了0.33g/L，產(chǎn)酒精率為0.8%（v/v），糖利用率較低，其糖濃度與還原糖量分別為12.1Brix和0.084g/L，說明在梨酒發(fā)酵中即不影響發(fā)酵菌株的酒精產(chǎn)量，又能達(dá)到增香的目的，是優(yōu)良的梨酒增香酵母。

2.3 產(chǎn)香酵母生物學(xué)特性的研究

2.3.1 YS03的水浸片顯微照片如圖1所示。

圖1 菌株YS03的水浸片顯微照片（10×40倍）Fig.1 Microscopic photos of water extraction of YS03 strain（10×40）

由圖1可以看出菌株YS03具有典型的酵母形態(tài)，細(xì)胞均呈圓形或橢圓形，生殖方式為單端出芽生殖。

2.3.2 YS03的生長曲線 菌株YS03的生長曲線如圖2所示。

圖2 菌株YS03的生長曲線Fig.2 Growth curve of YS03

從圖2可看出，YS03的延遲期為0～4h，4h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，直到16h后細(xì)胞數(shù)量趨于穩(wěn)定，開始進(jìn)入穩(wěn)定期，經(jīng)測(cè)定穩(wěn)定期細(xì)胞數(shù)量為1.2×108個(gè)/mL。

2.3.4 YS03最適生長溫度的確定 YS03的在麥芽汁培養(yǎng)基中的生長曲線如圖3所示，其最適生長溫度為28℃，最適生長溫度的范圍為26～32℃，生長溫度范圍較寬。

圖3 YS03在不同溫度下的生長曲線Fig.3 Curve of YS03 growth at different temperature

2.3.5 YS03最適生長pH的確定 將YS03在28℃不同pH的梨汁中培養(yǎng)，其結(jié)果如圖4所示。

由圖4可看出，YS03的最適生長pH是5.5，在5.1～5.9之間均能生長較好，其適應(yīng)性較強(qiáng)，與梨汁的自然pH非常接近。由于YS03長期生長在梨園的環(huán)境中，適應(yīng)于梨自然的酸度，故在生產(chǎn)中不需要進(jìn)行pH的調(diào)整，這樣既簡化了工藝流程，又減少了外來離子的干擾。

圖4 YS03在不同pH下的生長曲線Fig.4 Growth curve of YS03 at different pH value

2.3.6 YS03在發(fā)酵過程中總酯的變化情況 經(jīng)感官初步評(píng)定以及發(fā)酵5d后的各項(xiàng)指標(biāo)，確定YS03為產(chǎn)香酵母，其總酯的變化情況如圖5所示，在梨酒前酵的6d內(nèi)，總酯含量逐漸增加，發(fā)酵的第6d的香氣最濃，其總酯含量達(dá)到0.38g/L，到第7d略有下降。

圖5 菌株YS03在發(fā)酵過程中的總酯變化曲線Fig.5 Changes curve of the total ester in the fermentation

2.4 YS03的26S rDNA D1/D2區(qū)序列的鑒定結(jié)果

圖6 菌株YS03基于26SrDNA D1/D2序列及Neighbor－Joining法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree drawn from neighbor－joining analysis based on the 26SrDNA D1/D2 domain of YS03

YS03基于26SrDNA D1/D2序列及Neighbor－Joining法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖6所示，YS03（26SrDNA D1/D2序列登錄號(hào)為JN204428）和具有代表性的21株酵母進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，與模式菌株Issatchenkia orientalis NRRL Y－5396及Issatchenkia orientalis SM兩株酵母的相似度達(dá)到100%，故可斷定YS03和上述兩種酵母屬于同一個(gè)種，即東方伊莎酵母命名為Issatchenkia orientalis YS03。

3 結(jié)論

從自然發(fā)酵的梨酒中分離得到一株酵母菌YS03，該菌種產(chǎn)香濃郁，發(fā)酵速度較快，產(chǎn)酯率高，且糖利用率低，可以作為梨酒生產(chǎn)中的產(chǎn)香菌來使用。通過26S rDNA D1/D2區(qū)序列鑒定為東方伊莎酵母，命名為Issatchenkia orientalis YS03。

[1]王冉.酵母發(fā)酵黃花梨酒加工工藝研究[D].重慶：西南大學(xué)，2004.

[2]王延群.百果之宗話秋梨[J].養(yǎng)生大世界，2007（9）：34－35.

[3]曹新志，劉芳，株茜.梨果酒酵母的篩選及發(fā)酵條件的研究[J].中國釀造，2010（5）：102－105.

[4]李劍芳，張灝.發(fā)酵獼猴桃汁中產(chǎn)香酵母的分離、鑒定及生物學(xué)特性的研究[J].食品科學(xué)，2001，22（9）：19－22.

[5]何義，袁耀武，馬曉燕，等.一株適合鴨梨果酒釀造的產(chǎn)香酵母菌鑒定[J].中國食品學(xué)報(bào)，2007，7（5）：85－90.

[6]艾方，胡慧磊，彭麗桃.發(fā)酵柑桔汁中產(chǎn)香酵母的篩選及生長特性研究[J].中國釀造，2010（4）：67－70.

[7]肖陽，孫寶國，廖永紅，等.一株葡萄酒Pichia sp.菌的分離鑒定及其產(chǎn)香成分分析[J].食品工業(yè)科技，2010（8）：164－166， 169.

[8]金磊，董文賓，張丹，等.梨酒酵母的篩選及鑒定[J].食品工業(yè)科技，2012，33（10）：231－249.

[9]高健，鄧先余，康健，等.一株分離于湘江污染水域的酵母（Candida fermentati）的鑒定及其Cd2+的吸附性[J].海洋與湖沼，2010，41（3）：327－332.