遼寧省甜瓜新病害——果腐病病原菌生物學(xué)特性研究

侯 悅 劉志恒* 曹友文 趙廷昌

（1沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110161；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100193）

我國(guó)甜瓜種植面積占世界甜瓜總種植面積的45%以上，產(chǎn)量占55%以上（馬躍，2011），在我國(guó)農(nóng)業(yè)發(fā)展中具有重要作用，甜瓜在遼寧省種植比較普遍，且具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。甜瓜上主要病害有霜霉病、枯萎病、白粉病、疫病、炭疽病、細(xì)菌性葉斑病、細(xì)菌性軟腐病、病毒病等（李瑞琴 等，2004；宋伊波，2005；殷麗娟和高運(yùn)杰，2005；鄭順林 等，2006；李金堂，2010；李省印 等，2011）。甜瓜絲核菌果腐病是近年遼寧省甜瓜生產(chǎn)上的新病害，春茬大棚中甜瓜近收獲期發(fā)生較普遍。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于甜瓜絲核菌果腐病鮮見(jiàn)報(bào)道，尤其是系統(tǒng)性研究報(bào)道更為少見(jiàn)。意大利曾有過(guò)絲核菌引起甜瓜果腐的報(bào)道（Corazza et al.，1992）。我國(guó)內(nèi)蒙古（呂佩珂，1996）和山東（李金堂，2010）曾報(bào)道有該病的發(fā)生。但在遼寧至今尚未見(jiàn)由Rhizoctonia solani引起甜瓜果腐病及其病原菌生物學(xué)特性的研究報(bào)道。為明確甜瓜果腐病病原菌的生物學(xué)特性，探討病菌越冬侵染特點(diǎn)，本試驗(yàn)調(diào)查、采集、分離了甜瓜果腐病的病原菌，對(duì)病原菌生物學(xué)特性進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，以期為該病害發(fā)生規(guī)律的深入研究及病害防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

甜瓜病果標(biāo)樣于2011年7月采于遼寧省沈陽(yáng)市法庫(kù)縣。

1.2 病害癥狀描述

根據(jù)甜瓜病果的癥狀特點(diǎn)進(jìn)行描述記載。

1.3 病原菌鑒定

按常規(guī)方法對(duì)甜瓜果腐病標(biāo)樣進(jìn)行分離、培養(yǎng)、鑒定（陸家云，2002），描述記載病原菌形態(tài)。同時(shí)進(jìn)行菌絲融合群測(cè)定（陳延熙 等，1985；Sneh et al.，1991）及病菌rDNA-ITS序列測(cè)定（Saghai et al.，1984；Guo et al.，2000）。

1.4 病原菌生物學(xué)特性測(cè)定

1.4.1 不同培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)及菌核萌發(fā)的影響 選用2%水瓊脂、PDA、PSA、查氏、理查、孟加拉紅、燕麥片、黃瓜煎汁、甜瓜煎汁和胡蘿卜煎汁等10種培養(yǎng)基。移接直徑5 mm的菌餅，25 ℃恒溫培養(yǎng)。3次重復(fù)。采用十字交叉法每間隔24 h測(cè)量1次菌落直徑，計(jì)算各培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)速度，2 d后繪制菌絲生長(zhǎng)速度柱形圖，進(jìn)行方差分析和多重比較（方中達(dá)，1998）。22 d后比較不同培養(yǎng)基上菌核干質(zhì)量。菌核萌發(fā)率測(cè)定：采用上述10種培養(yǎng)基，每皿分別植入菌核40粒，25 ℃恒溫培養(yǎng)。3次重復(fù)。22 h后觀察菌核萌發(fā)情況，計(jì)算比較菌核萌發(fā)率。

1.4.2 不同溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)及菌核萌發(fā)的影響 選用PDA培養(yǎng)基，分別設(shè)置0、5、10、15、20、25、28、30、35、40 ℃共10個(gè)溫度梯度，菌餅應(yīng)用、其他培養(yǎng)條件、重復(fù)次數(shù)、菌絲、菌核干質(zhì)量及萌發(fā)率測(cè)定分析比較方法均同1.4.1。

1.4.3 不同pH值對(duì)菌絲生長(zhǎng)及菌核萌發(fā)的影響 選用PDA培養(yǎng)基，用0.1 mol·mL-1HCL和0.1 mol·mL-1NaOH調(diào)整PDA培養(yǎng)基pH值，pH值分別為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11共10個(gè)梯度。菌餅應(yīng)用、其他培養(yǎng)條件、重復(fù)次數(shù)、菌絲、菌核干質(zhì)量及萌發(fā)率測(cè)定分析比較方法同1.4.1。

1.4.4 不同光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)及菌核萌發(fā)的影響 選用PDA培養(yǎng)基，設(shè)光照24 h、黑暗24 h、光照/黑暗交替12 h/12 h共3個(gè)處理。菌餅應(yīng)用、其他培養(yǎng)條件、重復(fù)次數(shù)、菌絲、菌核干質(zhì)量及萌發(fā)率測(cè)定分析比較方法同1.4.1。

1.4.5 不同碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)及菌核萌發(fā)的影響 以PA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，選用葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、木糖、淀粉和山梨醇等9種碳源，用量2%（劉志恒 等，2010）。菌餅應(yīng)用、其他培養(yǎng)條件、菌絲、菌核干質(zhì)量及萌發(fā)率測(cè)定分析比較方法同1.4.1。

1.4.6 不同氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)及菌核萌發(fā)的影響 以不加NaNO3的查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，選取NaNO3、KNO3、（NH4）2SO4、蛋白胨、酵母浸粉、脲、甘氨酸、L-谷氨酸、L-精氨酸和L-半胱氨酸等10種氮源，用量0.2%（畢淑娟 等，2012）。菌餅應(yīng)用、其他培養(yǎng)條件、重復(fù)次數(shù)、菌絲、菌核干質(zhì)量及萌發(fā)率測(cè)定分析比較方法同1.4.1。

1.4.7 菌絲致死溫度 用無(wú)菌水配制菌絲懸浮液，移2 mL于滅菌試管中，分別置于46、47、48、49、50、51、52、53、54、55 ℃恒溫水浴鍋中處理10 min（預(yù)熱1 min），水浴后立即放入冷水中降至室溫，將試管內(nèi)菌絲轉(zhuǎn)入PDA 平板中置于25 ℃恒溫培養(yǎng)。3 次重復(fù)。3 d后根據(jù)菌絲是否萌發(fā)確定其致死溫度（吳海燕 等，2001）。

1.4.8 菌核致死溫度 將純培養(yǎng)的菌核置于含有2 mL無(wú)菌水的試管中，分別置于50、51、53、54、55、56、57、58、59、60℃恒溫水浴鍋中處理10 min（預(yù)熱1min），水浴后立即放入冷水中降至室溫，將菌核轉(zhuǎn)入PDA 平板中，每皿3粒，25 ℃恒溫培養(yǎng)。3 次重復(fù)。3 d后根據(jù)菌核是否萌發(fā)生成菌絲確定菌核致死溫度（吳海燕 等，2001）。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀描述

甜瓜果腐病主要為害近成熟果實(shí)（圖1）。初期發(fā)病部位產(chǎn)生褐色壞死斑點(diǎn)，病斑擴(kuò)展迅速，很快呈深褐色大型腐爛病斑，繼而侵染部位密生白色絮狀霉層，霉層擴(kuò)展迅速，有時(shí)邊緣呈厚密的白膜狀。受害部位自中心向外圍呈水漬狀濕腐。濕度大時(shí)，白色霉層覆滿整個(gè)病部。發(fā)病后期果實(shí)大部分或全部腐爛。

圖1 田間發(fā)病癥狀

2.2 病原菌形態(tài)觀察及鑒定結(jié)果

甜瓜果腐病病原菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌絲初為無(wú)色，成熟后呈淡褐色。菌絲多為近直角分支，分支基部多較縊縮，分支附近具隔膜。遠(yuǎn)基菌絲直徑0.9～6.5μm，近基菌絲直徑4.4～12.3 μm。菌絲成熟后相互糾集，形成灰色、褐色至深褐色菌核。菌核球形、橢球形或成片生長(zhǎng)；內(nèi)外層顏色較一致，結(jié)構(gòu)疏松；表面粗糙具微孔，濕度大時(shí)有液體從微孔中滲出（圖2、3）。

菌絲融合群測(cè)定結(jié)果表明，甜瓜果腐病菌屬于AG-4 HGI融合群。電泳檢測(cè)結(jié)果得到大小約667 bp的片段，將該rDNA-ITS序列與GenBank中相關(guān)菌株的ITS序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果表明，待測(cè)菌株與RhizoctoniasolaniAG-4 HGI（GenBank收錄號(hào)：JN254788.1）的同源性達(dá)到99%（表1），證實(shí)所測(cè)病菌為無(wú)性態(tài)真菌茄絲核菌Rhizoctonia solani。

2.3 病原菌生物學(xué)特性測(cè)定結(jié)果

2.3.1 不同培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)及菌核萌發(fā)的影響 圖4表明，病菌在甜瓜煎汁培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快，其次為PSA培養(yǎng)基，在理查培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最慢。在不同培養(yǎng)基上菌核萌發(fā)率差異明顯，在胡蘿卜煎汁培養(yǎng)基上菌核萌發(fā)率最高，達(dá)95%，而在2%水瓊脂培養(yǎng)基上菌核萌發(fā)率最低。測(cè)定菌核干質(zhì)量，理查培養(yǎng)基上產(chǎn)生的菌核干質(zhì)量最大（424.50 mg），但成熟度差，其次為查氏培養(yǎng)基（257.07 mg），水瓊脂產(chǎn)生的菌核量最少（4.40 mg）。

圖2 菌絲

圖3 菌核

表1 待測(cè)菌株核糖體脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列與基因庫(kù)中相關(guān)菌株轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列同源性比較

圖4 不同培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)及菌核萌發(fā)的影響

2.3.2 不同溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)及菌核萌發(fā)的影響 圖5表明，菌絲在5～40 ℃均可生長(zhǎng)，25～30℃為適宜溫度，菌絲生長(zhǎng)致密，28 ℃為最適。菌核萌發(fā)率測(cè)定結(jié)果表明，不同溫度下菌核萌發(fā)率差異顯著，22 h后在15～40 ℃范圍內(nèi)菌核均可萌發(fā)，但溫度≤15 ℃或≥40 ℃菌核未見(jiàn)萌發(fā)。28 ℃為最適溫度，萌發(fā)率100%。此外，測(cè)定菌核干質(zhì)量，25 ℃下菌核產(chǎn)生量最大（94.25 mg），5、10、40 ℃下無(wú)菌核產(chǎn)生。

2.3.3 不同pH值對(duì)菌絲生長(zhǎng)及菌核萌發(fā)的影響 病菌對(duì)PDA培養(yǎng)基酸堿要求不嚴(yán)格，pH 2～11范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)。pH 6～8時(shí)菌落擴(kuò)展最快，生長(zhǎng)致密，pH 7為最適pH。在pH 3～11間菌核均可萌發(fā)，pH 7時(shí)萌發(fā)率最高，達(dá)85%以上（圖6）。測(cè)定菌核干質(zhì)量，pH 7條件下最易產(chǎn)生菌核（110.51 mg）。

圖5 不同溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)及菌核萌發(fā)的影響

2.3.4 不同光照條件對(duì)菌絲生長(zhǎng)及菌核萌發(fā)的影響 試驗(yàn)結(jié)果表明，不同光照條件對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響不明顯，黑暗條件略優(yōu)于光暗交替和光照條件。從菌核萌發(fā)看，黑暗條件略優(yōu)，而光暗交替條件較差，萌發(fā)率僅為75%（圖7）。此外，從菌核產(chǎn)生看，黑暗條件利于菌核產(chǎn)生（92.38 mg）。

圖6 不同pH值對(duì)菌絲生長(zhǎng)和菌核萌發(fā)的影響

圖7 不同光照條件對(duì)菌絲生長(zhǎng)及菌核萌發(fā)的影響

2.3.5 不同碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)及菌核萌發(fā)的影響 以PA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，病菌在供試9種碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)差異顯著（圖8），在以可溶性淀粉為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快，在以木糖為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最慢。菌核萌發(fā)對(duì)9種碳源的利用差異顯著，麥芽糖促進(jìn)作用明顯，菌核萌發(fā)率達(dá)85%以上。測(cè)定菌核干質(zhì)量，以山梨醇為碳源的培養(yǎng)基利于菌核產(chǎn)生，干質(zhì)量最大（79.67 mg），而以木糖為碳源的培養(yǎng)基不利于菌核產(chǎn)生，菌核量最少（26.00 mg）。

2.3.6 不同氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)及菌核萌發(fā)的影響 以不加NaNO3的查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，菌絲生長(zhǎng)對(duì)不同氮源的利用差異顯著，以蛋白胨為最適，生長(zhǎng)速度明顯優(yōu)于其他培養(yǎng)基。不同氮源對(duì)菌核萌發(fā)的影響差異明顯，以蛋白胨為氮源時(shí)有利于菌核萌發(fā)，萌發(fā)率達(dá)90%（圖9）。此外，以KNO3為氮源有利于菌核產(chǎn)生，菌核干質(zhì)量最大（180.10 mg），以L-半胱氨酸為氮源時(shí)產(chǎn)生的菌核量最少（7.43 mg）。

圖8 不同碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)及菌核萌發(fā)的影響

圖9 不同氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)及菌核萌發(fā)的影響

2.3.7 菌絲致死溫度 經(jīng)溫度≥50 ℃處理10 min，菌絲均未生長(zhǎng)，確定菌絲致死溫度為50 ℃、10 min。

2.3.8 菌核致死溫度 經(jīng)溫度≥53 ℃處理10 min，菌核均不萌發(fā)，確定菌核致死溫度為53 ℃、10 min。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，茄絲核菌在供試10種培養(yǎng)基上均可生長(zhǎng)，但在理查培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較緩慢；28 ℃為病菌菌絲最適生長(zhǎng)溫度，溫度≤5 ℃或溫度≥40 ℃菌絲停止生長(zhǎng)，結(jié)果與肖功年等（1999）和陳京元等（2006）的相關(guān)報(bào)道相似，但與曠玲等（2008）和張勇等（2010）的研究結(jié)論略有差異。由此認(rèn)為雖然同為茄絲核菌（Rhizoctonia solani），但是由于其寄主及生長(zhǎng)環(huán)境不同或是菌群分化等原因，使得病原菌某些生物學(xué)特性也具有一定的差異性，尚待深入研究。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，pH 6～8范圍既適合菌絲生長(zhǎng)也適合菌核的萌發(fā)。不同光照條件下菌絲生長(zhǎng)無(wú)明顯差異，說(shuō)明光照對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)的影響不大。在供試9種碳源和10種氮源中，分別以可溶性淀粉和蛋白胨作為碳、氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)最有利。對(duì)于菌核的形成，最適碳源為山梨醇，最適氮源為KNO3。以麥芽糖為碳源的PA培養(yǎng)基和以蛋白胨為氮源的查氏培養(yǎng)基有利于菌核萌發(fā)。說(shuō)明菌絲生長(zhǎng)、菌核形成及菌核萌發(fā)對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的需求存在一定差異。菌核萌發(fā)的最適pH值和最適溫度均與菌絲生長(zhǎng)的相同，但菌核萌發(fā)與菌絲生長(zhǎng)的溫度范圍存在一定差異，菌核在15～40 ℃范圍22 h后可以萌發(fā)，而15 ℃下需要培養(yǎng)3 d后才能萌發(fā)，溫度≤10 ℃或溫度≥40℃繼續(xù)培養(yǎng)仍不能萌發(fā)；菌絲在5～40 ℃均可生長(zhǎng)，說(shuō)明菌核萌發(fā)對(duì)溫度的要求比菌絲生長(zhǎng)對(duì)溫度的要求嚴(yán)格，這些特性和病害田間的發(fā)生時(shí)期相吻合，因此甜瓜茄絲核菌果腐病在初春病害初侵染時(shí)即應(yīng)進(jìn)行防治。

病菌菌絲致死溫度為50 ℃、10 min，與楊子祥等（2009）報(bào)道的香石竹立枯病菌的菌絲致死溫度相同，而人工培養(yǎng)的菌核致死溫度為53 ℃、10 min，高于菌絲，說(shuō)明菌核的抗逆性相對(duì)較強(qiáng)，與劉志恒等（2010）報(bào)道的老熟菌核可在土壤中越冬存活幾年而仍具有萌發(fā)和致病能力的結(jié)論較為一致。本試驗(yàn)結(jié)果對(duì)于生產(chǎn)上有針對(duì)性地?cái)M定病害防治措施，具有一定參考意義。

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