黃瓜轉(zhuǎn)錄因子CsCBF3的克隆及表達分析

寧 宇 苗永美，2 李 季 婁群峰 翁益群 陳勁楓*

（1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室，江蘇南京 210095；2安徽科技學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽鳳陽 233100；3美國威斯康星大學(xué)園藝系，威斯康星麥迪遜 53706）

黃瓜轉(zhuǎn)錄因子CsCBF3的克隆及表達分析

寧 宇1苗永美1，2李 季1婁群峰1翁益群3陳勁楓1*

（1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室，江蘇南京 210095；2安徽科技學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽鳳陽 233100；3美國威斯康星大學(xué)園藝系，威斯康星麥迪遜 53706）

利用RT-PCR技術(shù)從黃瓜中克隆了植物低溫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子C-repeat-Binding Factor3，將其命名為CsCBF3，GenBank登錄號為JQ900769。CsCBF3基因開放閱讀框全長為615 bp，編碼204個氨基酸。進化樹分析表明，CsCBF3隸屬于CBF基因家族，與葡萄CBF3蛋白親緣關(guān)系最近，而與黑麥草、水稻CBF3蛋白親緣關(guān)系較遠。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，CsCBF3編碼的蛋白包含保守的AP2dNA結(jié)合域，N端的核定位信號區(qū)和C端的酸性氨基酸富集區(qū)，且該蛋白中的一些磷酸化位點及二級結(jié)構(gòu)在與DNA互作過程中發(fā)揮重要作用。熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示低溫可誘導(dǎo)CsCBF3的表達，且其表達量在迅速達到峰值后又降低，說明CsCBF3是一個快速響應(yīng)基因，推測其在黃瓜耐冷過程中起著重要的作用。

黃瓜；低溫；CBF3；基因克??；表達分析

黃瓜（Cucumis sativus L.）屬葫蘆科甜瓜屬，是一種深受大眾喜愛的世界性蔬菜。黃瓜原產(chǎn)于喜馬拉雅山南麓的印度北部地區(qū)（陳勁楓，2008），喜溫暖濕潤的氣候，低溫會使黃瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)下降，最終造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失，因此，提高黃瓜耐冷性具有非常重要的實踐意義。目前的研究多利用一氧化氮、多胺、水楊酸等外源物質(zhì)來提高黃瓜在低溫環(huán)境下的適應(yīng)能力（徐洪雷和于廣建，2007；Zhang et al.，2009；王磊 等，2010），而有關(guān)黃瓜耐冷分子調(diào)控機理的報道則較少。

CBF3（C-repeat-Binding Factors）屬于 A P2/EREBP（Ethylene-responsive element binding protein）基因家族，是一種受低溫特異誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子，可激活下游多個效應(yīng)基因表達，從而提高植物對低溫、干旱等多種逆境脅迫的抗性（Yang et al.，2005）。該轉(zhuǎn)錄因子首先在對擬南芥的研究中被發(fā)現(xiàn)（Yamaguchi-Shinozaki & Shinozaki ，1994），隨后在油菜（Jaglo et al.，2001）、水稻（Dubouzet et al.，2003）等作物上也分離克隆出了CBF3基因，且證明其可被低溫環(huán)境所誘導(dǎo)。由于CBF3可調(diào)控多個相關(guān)基因來提高植物的抗性，因此克隆CBF3基因和利用基因工程技術(shù)為改良植物耐冷品質(zhì)提供了更好的選擇，目前已有研究表明CBF3可顯著提高轉(zhuǎn)基因植株如高羊茅（Zhao et al.，2007）、黑麥草（Li et al.，2011）、煙草（Yang et al.，2011）等作物的耐冷性。而在黃瓜中，該基因的功能和分子作用機制還尚未明確。

本試驗從黃瓜耐冷品種Chipper中克隆到了黃瓜CBF3基因，對其編碼的氨基酸序列進行了生物信息學(xué)分析，為明確基因功能奠定了基礎(chǔ)。同時利用熒光定量技術(shù)研究了低溫脅迫與黃瓜CBF3表達量之間的關(guān)系，以期從一定程度上揭示黃瓜耐冷的 分子調(diào)控機理。

1 材料與方法

1.1 材料

以南京農(nóng)業(yè)大學(xué)葫蘆科作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新實驗室保存的美國生態(tài)型黃瓜Chipper為試材。試驗于2011年秋季在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)進行，選取飽滿的種子浸種催芽，將露白的種子播于育苗穴盤中，在晝溫25℃，夜溫18℃，光照12 h的人工氣候箱中培養(yǎng)。當(dāng)幼苗長至2～3片真葉時，將幼苗放置于4℃的人工氣候箱中，分別于處理0、2、4、8、12、24 h后取幼嫩葉片，置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 DNA、RNA的提取及cDNA第一鏈的合成 黃瓜DNA的提取采用SDS-CTAB法（江彪，2011）。按Trizol法提取總RNA，并參照TAKARA公司的DNase I試劑盒說明消除微量DNA污染。取純化后的總RNA用于cDNA第一鏈的合成（PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit，TAKARA）。

1.2.2 CsCBF3基因的克隆 以擬南芥CBF3基因（AEE85065）的核酸序列為信息探針，在黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫（http://cucumber.genomics.org.cn/page/cucumber/index.jsp）中進行Blast同源搜索，找到黃瓜CBF3基因。根據(jù)開放閱讀框的上下游末端設(shè)計引物，引物序列CBF3-F:5′-ATGTCTTCTTCGTCTTCAAGCT-3′；CBF3-R:5'-TCACTCATGACTCCATAACGAC-3′。 引 物委托上海英駿生物科技公司合成。

分別以基因組DNA和cDNA為模板進行擴增，PCR擴增程序為:94℃預(yù)變性5min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1min，35個循環(huán)；72℃7min。PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳，按凝膠回收試劑盒說明書回收目的片段，并將其克隆在pMD19-T載體上。熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑經(jīng)Amp抗性篩選和菌液PCR檢測鑒定過的陽性克隆送交南京金斯瑞公司測序。

1.2.3 CsCBF3蛋白的生物信息學(xué)分析 利用DNAman6.0軟件對CsCBF3編碼的氨基酸序列進行比對和分析。系統(tǒng)進化樹由MEGA5.0構(gòu)建，采用鄰接法（Neighbor Joiningmethod）作圖，重復(fù)計算次數(shù)設(shè)為1000。分別使用Expasy蛋白質(zhì)組分析工具中的ProtParam軟件（http://web.expasy.org/protpara）和 COR軟件（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html）對蛋白質(zhì)進行理化性質(zhì)分析和二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。蛋白質(zhì)翻譯后修飾的磷酸化位點分析采用在線軟件Netphos2.0 Server完成（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）。利用在線工具Smart分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域（http://smart.embl-heidelberg.de/）。

1.2.4 實時定量PCR檢測CsCBF3基因的表達 提取低溫脅迫下不同時間段內(nèi)（0、2、4、8、12、24 h）的黃瓜葉片的總RNA，經(jīng)DNase I消化后反轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈，取適量作為模板。

根據(jù)已獲得的CsCBF3的開放閱讀框全長序列設(shè)計實時定量PCR引物，引物序列qCBF3-F:5'-CTCAACCAACGACCACCT-3'；qCBF3-R:5'- CGCAAACCCATTTACCAT-3′， 擴 增 片 段長度為128 bp。選取黃瓜看家基因EF1a作為內(nèi)參，引物序列EF1a-F:5'-ACTGTGCTGTCCTCATTATTG-3′；EF1a-R:5'- AGGGTGAAAGCAAGAAGAGC-3′。

試驗在Bio-Rad iCycler iQ實時定量PCR 儀上進行，每個樣品設(shè)3次重復(fù)。反應(yīng)采用20 μL體系，包括1μL cDNA，上、下游引物各1μL，10μL iQTMSYBR?green Supermix（Bio-Rad），7μLddH2O。兩步法擴增，具體程序為:95℃預(yù)變性2min，95℃變性5 s，60℃退火30 s，40個循環(huán)，然后進行融解曲線分析。

將正常條件下CsCBF3的表達量設(shè)為1，按照2-ΔΔCT法計算出基因的相對表達量，采用Excel軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 CsCBF3基因的克隆

以cDNA第一鏈為模板，用引物CBF3-F/CBF3-R擴增出了615 bp左右的目的片段（圖1）。測序結(jié)果顯示該片段與黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫中目的基因核酸序列的一致性為100%，表明已成功克隆到黃瓜CBF3基因，命名為CsCBF3，GenBank登錄號為JQ900769。與黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫比對分析發(fā)現(xiàn)CsCBF3基因沒有內(nèi)含子；以黃瓜基因組DNA為模板也可擴增出同樣大小的片段（圖1），再次證明了該基因不含有內(nèi)含子，這與已報道的擬南芥CBF3基因的結(jié)構(gòu)特征相一致（Gilmour et al.，1998）。

2.2 CsCBF3氨基酸序列比對及進化樹分析

圖1 瓊脂糖電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物

利用DNAman6.0對CsCBF3編碼的氨基酸序列與其他物種的CBF3氨基酸序列進行同源比對分析。比對結(jié)果顯示，黃瓜CBF3氨基酸序列與擬南芥（ABV27154）的相似性最高，達到43.70%，其次是葡萄（ACT45468）和辣椒（ADM73296），分別為41.84%、36.52%，而與茄子（AAS77819）、蒺藜苜蓿（ABG75914）、黑麥草（AAX57275）、水稻（AEW67332）、大麥（ABE02655）、玉米（NP001105651）和大豆（ACA63936）等物種的CBF3蛋白相似性較低（圖2）。由MEGA5.0構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹表明黃瓜CBF3與葡萄CBF3的親緣關(guān)系最近，在進化上屬同一分支，而與水稻、黑麥草的CBF3蛋白的親緣關(guān)系則較遠（圖3）。

圖2 CsCBF3與其他物種CBF3蛋白氨基酸序列的同源性比對

圖3 黃瓜及其他物種CBF3蛋白進化樹分析

2.3 CsCBF3蛋白結(jié)構(gòu)與功能分析

CsCBF3基因編碼的多肽鏈包含204個氨基酸殘基，等電點（PI）為8.42，不穩(wěn)定系數(shù)為64.86，較高，符合其轉(zhuǎn)錄因子的特性。大量研究報道表明，轉(zhuǎn)錄因子的功能活性受到磷酸化修飾的調(diào)控（Ciceri et al.，1997），因此本試驗對CsCBF3蛋白的磷酸化位點進行了預(yù)測和分析。如圖4所示，分值大于0.5的磷酸化位點有:絲氨酸磷酸化位點12個，蘇氨酸磷酸化位點2 個，酪氨酸磷酸化位點1個，這些磷酸化位點大部分集中于氨基酸序列100～150范圍內(nèi)（圖4）。

圖4 CsCBF3蛋白序列磷酸化位點分析

在蛋白二級結(jié)構(gòu)上，CsCBF3基因編碼的肽鏈具有3個結(jié)構(gòu)域，即N端信號區(qū)域（第1～35位）、AP2/EREBPdNA結(jié)合域（第36～98位）和C端酸性激活區(qū)域（第99～204位）。其中在第20～32位序列區(qū)段內(nèi)富含多個堿性氨基酸（精氨酸R和賴氨酸K），為該轉(zhuǎn)錄因子的核定位信號區(qū)NLS（圖2），轉(zhuǎn)錄因子CsCBF3進入細胞核的過程受到該區(qū)域的調(diào)控。在AP2dNA結(jié)合域內(nèi)存在著3個β折疊和1個α螺旋（圖5），這些結(jié)構(gòu)在參與識別各類順式作用元件及同轉(zhuǎn)錄因子或DNA的相互作用中起關(guān)鍵作用（Allen et al.，1998；Kanaya et al.，1999）。

圖5 CsCBF3蛋白二級結(jié)構(gòu)分析

2.4 CsCBF3基因在不同逆境脅迫下的表達分析

利用熒光定量PCR技術(shù)檢測了CsCBF3在低溫脅迫下表達量的變化情況，結(jié)果表明（圖6），CsCBF3在低溫處理后的表達量顯著高于處理前，證明低溫可誘導(dǎo)CsCBF3的表達。當(dāng)黃瓜受到低溫脅迫后，CsCBF3的表達量迅速增加并在2 h時達到峰值，約為對照的56倍，在隨后4～8 h內(nèi)表達量下降，而后又有所上升。這種變化規(guī)律說明CsCBF3可能在快速提高黃瓜對低溫脅迫抵抗能力的過程中起著非常重要的作用。

圖6 熒光定量PCR檢測CsCBF3在低溫脅迫下的表達

3 討論

本試驗通過RT-PCR技術(shù)首次克隆到了黃瓜CBF3基因（JQ900769），并從生物信息學(xué)的角度對其編碼的氨基酸序列進行了分析，為該基因的功能鑒定奠定了基礎(chǔ)。CsCBF3蛋白不穩(wěn)定系數(shù)高，不含跨膜結(jié)構(gòu)域和信號肽，推測其可能在細胞質(zhì)內(nèi)發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄因子的作用。CsCBF3蛋白具有12個潛在的磷酸化位點，說明其可能在翻譯后通過磷酸化和去磷酸化修飾而完成該轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合的過程（Medina et al.，1999），其中第37位的酪氨酸、第67位的絲氨酸位于AP2基因家族保守的AP2/EREBPdNA結(jié)合域內(nèi)，因此可推斷這兩個氨基酸殘基在蛋白與DNA結(jié)合過程中發(fā)揮著非常重要的作用。同源比對結(jié)果顯示，CsCBF3與擬南芥CBF3相似度較高，表明其可能具有相同的分子生物學(xué)作用，但還需要進一步的試驗驗證。

轉(zhuǎn)錄因子CBF3在植物低溫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮著重要的作用。當(dāng)?shù)蜏孛{迫發(fā)生時，CBF3基因被誘導(dǎo)激活，與CRT/DRE順式作用元件特異結(jié)合，激活下游多個啟動子區(qū)域含有該元件的效應(yīng)基因表達，從而提高植物對低溫及其他脅迫的抵抗能力（Liu et al.，1998；Fowler & Thomashow，2002；Gilmour et al.，2004）。水稻上的研究表明，CBF3是一個快速響應(yīng)基因，可在短時間內(nèi)提高植株的耐冷性，當(dāng)脅迫時間過長時，CBF3的表達量會因受到MYBS3基因的抑制而降低，同時MYBS3表達量逐漸升高，提高了水稻對長期低溫環(huán)境的耐受性（Su et al.，2010）。本試驗中熒光定量PCR檢測結(jié)果表明，CsCBF3的表達量一般在脅迫2 h后就達到峰值，證明其是一個快速響應(yīng)基因。隨后其表達量先是降低，而后又有所升高，這與水稻CBF3基因的表達模式略有不同，推測在黃瓜中可能并不存在一個特異的基因?qū)ｉT負責(zé)調(diào)控長時間的低溫脅迫，而是由CsCBF3在整個脅迫過程中發(fā)揮作用。

此外，筆者還成功構(gòu)建了由CaMV35S啟動子驅(qū)動的植物表達載體pCAMBIA1304-CsCBF3，對黃瓜的遺傳轉(zhuǎn)化工作正在進行中，以期能進一步對CsCBF3的功能進行驗證，同時也希望能夠獲得對低溫有較高耐受性的轉(zhuǎn)基因黃瓜植株，為黃瓜耐冷育種提供新的種質(zhì)資源材料。

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Cloning and Expression Analysis of Transcription Factor CsCBF3gene from Cucumber

NING Yu1，MIAO Yong-mei1，2，LI Ji1，LOU Qun-feng1，WENG Yi-qun3，CHEN Jin-feng1*
（1State Key Laboratory of Cropgenetics andgermplasm Enhancement，College of Horticulture，Nanjing Agricultural University，Nanjing210095，Jiangsu，China；2College of Life Science，Anhui Science and Technology University，F(xiàn)engyang233100，Anhui，China；3Horticulturedepartment，University of Wisconsin，Madison53706，USA）

In order todetermine its role in cold response in cucumber （Cucumis sativus L.），CsCBF3 was cloned from Chipper using RT-PCRmethod and itsgenBank accession number was JQ900769.CsCBF3 had an open reading frame of615 bp，which was supposed to encode a protein of204 amino acids.Phylogenetic tree analyses showed that CsCBF3 belonged to CBFgene family and had close relationship with CBF3 from Vitis amurensis，while had far relationship with CBF3 fromLolium perenne and Oryza sativa.Bioinformatics analysis showed that CsCBF3 protein was consisted of AP2dNA bindingdomain，which included amino acid residues，nuclear localization signal region and acidic activationdomain，and some phosphorylation sites and protein secondary structuresmay play important roles in process of interactions between proteins anddNA.Quantitative real-time PCR results showed that expression of CsCBF3 could be induced by low temperature，and the level reached to peak very fast and thendecreased.These results suggested that CsCBF3 was a rapid responsegene and played an important role in resistance to low temperature in cucumber.

Cucumber；Low temperature；CBF3；GenECloning；Expressive analysis

S642.2

A章編號:1000-6346（2013）06-0030-07

2012-09-17；接受日期:2012-11-23

國家“973”計劃項目（2009CB119001），國家自然科學(xué)基金重點項目（30830079），江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新基金項目（CX（11）1002）

寧宇，男，碩士研究生，專業(yè)方向:蔬菜生物技術(shù)，E-mail:2010104050@njau.edu.cn

*通訊作者（Corresponding author）:陳勁楓，男，教授，博士生導(dǎo)師，專業(yè)方向:蔬菜遺傳育種與生物技術(shù)，E-mail:jfchen@njau.edu.cn