經(jīng)輸血感染的HIV/AIDS患者HIV-1耐藥基因突變研究

路新利，趙宏儒，張玉琪，趙翠英，李韓平，白廣義，李巧敏，陳志強(qiáng)，李保軍，劉麗花

經(jīng)血液傳播是HIV效率最高的傳播方式，輸入被HIV污染的血液或生物制劑感染HIV的概率幾乎為100%[1]。部分HIV-1感染者或患者在藥物選擇壓力等因素的影響下體內(nèi)可產(chǎn)生耐藥毒株。本研究采用基因型檢測(cè)法對(duì)經(jīng)輸血感染且正在進(jìn)行抗病毒治療的HIV/AIDS患者的耐藥基因突變情況進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 河北省轄區(qū)內(nèi)部分經(jīng)血液感染HIV-1且病毒載量≥1000拷貝/ml的患者37例，采集其EDTA抗凝全血10ml，取50μl進(jìn)行CD4細(xì)胞絕對(duì)數(shù)檢測(cè)，分離血漿后進(jìn)行病毒載量和耐藥基因型檢測(cè)。37例患者中，有償獻(xiàn)血者占62.2%(23/37)，受血者占37.8%(14/37)；男16例，女21例，平均年齡42.6(16～62)歲，以青壯年為主。HIV-1亞型分布為：CRF01-AE亞型2例，B亞型35例。

1.2 抗病毒治療方案 33例采用D4T(司他夫定)/3TC(拉米夫定)/NVP(奈韋拉平)方案，占89.2%；2例采用3TC/AZT(齊多夫定)/NVP 方案，占5.4%(2/37)；2例采用3TC/TDF(替諾福韋酯)/克立芝(LPV/r)方案，占5.4%(2/37)。治療時(shí)間平均為4.32(0.5～6)年。

1.3 CD4+T淋巴細(xì)胞和HIV載量測(cè)定 采用流式細(xì)胞儀(FACSCount，美國(guó)BD公司)和自動(dòng)載量?jī)x(COBAS AMPLlCOR，美國(guó)Roche公司)及其配套試劑盒分別測(cè)定CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)和HIV載量，并對(duì)病毒載量測(cè)定結(jié)果取對(duì)數(shù)值。HIV-1載量?jī)x檢測(cè)范圍為400.0～7.5×105拷貝/ml。

1.4 HIV-1 RNA提取和耐藥基因型檢測(cè) 按照參考文獻(xiàn)[2]的方法進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1 CD4+T細(xì)胞數(shù)量和病毒載量結(jié)果分析 根據(jù)抗艾滋病毒治療免疫學(xué)失敗標(biāo)準(zhǔn)[3]和病毒學(xué)抑制失敗標(biāo)準(zhǔn)[4]，本組患者2010年的檢測(cè)數(shù)據(jù)顯示，46.0%(17/37)的患者CD4+T細(xì)胞數(shù)降回到或低于治療前水平(≤200個(gè)/μl)，免疫重建失敗，67.6%(25/37)的患者不完全抑制(病毒載量≥104拷貝/ml)，病毒學(xué)抑制失敗，37.8%(14/37)的患者病毒學(xué)和免疫學(xué)均失敗。相關(guān)性分析結(jié)果表明CD4+T細(xì)胞數(shù)與病毒載量呈明顯負(fù)相關(guān)(r=－8.165，P＜0.01)。在發(fā)生耐藥性突變的20例患者中，19例患者屬于免疫學(xué)失敗或病毒學(xué)失敗，另1例HB079患者連續(xù)3年病毒載量持續(xù)上升，CD4+T細(xì)胞數(shù)逐年下降，抗病毒治療失效或失敗(表1)。

2.2 不同治療方案耐藥結(jié)果分析 根據(jù)斯坦福大學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[2]，本組患者采用的3種治療方案中，D4T/3TC/NVP方案耐藥發(fā)生率最高，達(dá)到54.6%(18/33)，其中高度耐藥發(fā)生率為45.5%(15/33)。3TC/AZT/NVP方案和3TC/TDF/克立芝方案耐藥發(fā)生率均為50.0%(1/2)，前者1例患者發(fā)生高度耐藥，后者1例發(fā)生潛在低度耐藥。發(fā)生耐藥突變的20例患者均為HIV-1 B亞型毒株感染。

表1 20例發(fā)生耐藥突變的患者CD4+ T細(xì)胞絕對(duì)數(shù)和病毒載量變化Tab.1 Absolute number of CD4+ T cell and virus load in 20 patients with drug resistance

2.3 蛋白酶編碼區(qū)耐藥基因突變 有3例患者在治療過程中發(fā)生了蛋白酶抑制劑(PIs)位點(diǎn)突變，其中主要位點(diǎn)突變V32AV 1例，次要位點(diǎn)突變L10I 1例﹑A71T/V 3例，此外還有L63P﹑V77I﹑I93L等突變，但均未引發(fā)PIs耐藥。

2.4 反轉(zhuǎn)錄酶編碼區(qū)耐藥基因突變 23例患者體內(nèi)HIV-1發(fā)生了反轉(zhuǎn)錄酶基因突變，包括M184V﹑TAMs﹑Q151M復(fù)合體﹑K103N﹑Y181C等。其中核苷類反轉(zhuǎn)酶抑制劑(NRTIs)位點(diǎn)突變V118I(1例)﹑非核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTIs)位點(diǎn)突變V106IV(1例)和E138A(1例)未引發(fā)任何反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(RTIs)耐藥，其他20例患者體內(nèi)HIV-1遺傳基因突變均不同程度地導(dǎo)致了RTIs耐藥(表2)，RTIs耐藥發(fā)生率為54.1%(20/37)。在發(fā)生反轉(zhuǎn)錄酶突變的患者中有9例對(duì)斯坦福數(shù)據(jù)庫(kù)中的11種藥物全部耐藥，其中4例體內(nèi)的HIV-1發(fā)生了TAMs突變，2例發(fā)生了Q151M復(fù)合體突變，治療方案均為D4T/3TC/NVP。

表2 反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑相關(guān)耐藥突變Tab.2 Drug resistant mutation of reverse transcriptase inhibitors

3 討 論

河北省于1989年報(bào)告了首例HIV-1感染者，1995年從1例有償獻(xiàn)血者體內(nèi)檢測(cè)到HIV-1抗體，同時(shí)受血人群中也發(fā)現(xiàn)了HIV-1感染者[5]，20世紀(jì)90年代中期出現(xiàn)了HIV-1感染“局灶性”爆發(fā)現(xiàn)象。隨著HIV血液篩查的實(shí)施，經(jīng)輸血感染HIV的概率逐年下降，但高活性抗反轉(zhuǎn)錄病毒療法(HAART)可能會(huì)誘發(fā)耐藥HIV-1的出現(xiàn)[6-7]，為防止耐藥HIV-1傳播，必須加強(qiáng)耐藥性監(jiān)測(cè)。

本組37例經(jīng)輸血感染HIV-1的患者自2003年先后接受HAART以來，有20例體內(nèi)HIV-1遺傳基因發(fā)生了突變，產(chǎn)生了耐藥性，耐藥發(fā)生率為54.1%(20/37)。耐藥性突變主要發(fā)生于依從性差﹑CD4+T細(xì)胞數(shù)較低﹑治療效果不好的病例[8-10]。本組發(fā)生耐藥突變的20例患者中包含19例病毒學(xué)失敗或免疫學(xué)失敗的患者，說明基因突變是導(dǎo)致病毒學(xué)失敗或免疫學(xué)失敗的主要原因。這20例患者中有18例治療時(shí)間在3年以上，其中HB340和HB503的治療時(shí)間分別為半年和2年，但免疫重建和病毒抑制失敗，可能與其感染耐藥毒株有關(guān)(表1)。90%(18/20)的耐藥患者長(zhǎng)期使用D4T/3TC/NVP方案，抗病毒藥物的應(yīng)用可能誘發(fā)了HIV相應(yīng)基因位點(diǎn)的耐藥性突變[8]。此外，藥物依從性﹑患者的吸收能力等也是影響抗病毒治療效果﹑促發(fā)耐藥的重要影響因素[3]。

本研究顯示，20例發(fā)生耐藥突變的患者中有7例未發(fā)生NRTIs突變，1例未發(fā)生NNRTIs突變，且該例患者只發(fā)生了D67DN突變導(dǎo)致的AZT和D4T耐藥。參加3TC/AZT/NVP治療的HB303患者和參加3TC/TDF/克立芝治療的HB306患者都發(fā)生了單位點(diǎn)突變(K103N和V179D)，分別導(dǎo)致DLV﹑EFV﹑NVP高度耐藥和DLV﹑EFV﹑ETR﹑NVP潛在低度耐藥，說明合適的治療方案能夠降低病毒復(fù)制能力，減少耐藥的發(fā)生。TDF﹑克立芝等二線藥物治療效果好于一線藥物D4T﹑3TC﹑NVP﹑AZT，但是隨著二線藥物的逐漸應(yīng)用，對(duì)二線藥物的耐藥突變也逐漸增多。

本研究還顯示，蛋白酶編碼區(qū)出現(xiàn)了主要位點(diǎn)突變V32AV(1例)，次要位點(diǎn)突變L10I(1例)﹑A71T/V(3例)和其他突變?nèi)鏛63P﹑V77I﹑I93L等，但這些位點(diǎn)突變均未引發(fā)PIs耐藥。在32位點(diǎn)，V32AV是一個(gè)極其少見的位點(diǎn)突變，通常該位點(diǎn)突變單獨(dú)出現(xiàn)時(shí)不會(huì)導(dǎo)致蛋白酶抑制劑藥效降低或失效。未參加治療的患者體內(nèi)HIV-1病毒發(fā)生多態(tài)性突變A71T﹑L10I﹑A71T/V的概率為2%～3%，但在蛋白酶抑制劑的選擇壓力下A71T/V突變概率會(huì)升高。當(dāng)A71T/V突變合并其他突變時(shí)可降低所有蛋白酶抑制劑的敏感性[11]。L10I通常會(huì)和其他突變同時(shí)出現(xiàn)，對(duì)大多數(shù)蛋白酶抑制劑產(chǎn)生耐藥性，L10I在未治療患者體內(nèi)出現(xiàn)的概率為5%～10%。雖然這些突變本身不會(huì)直接導(dǎo)致耐藥的發(fā)生，但可降低耐藥的基因屏障[12-13]。63﹑77﹑93位點(diǎn)存在多態(tài)性，本身不引起耐藥，但與其他蛋白酶突變并存時(shí)有助于耐藥性的產(chǎn)生。L63P﹑I93L合并其他蛋白酶抑制劑突變時(shí)能增加蛋白酶抑制劑的耐藥性，V77I與輕微降低NFV(奈非那韋)敏感性有關(guān)[11]。

本組患者中反轉(zhuǎn)錄酶編碼區(qū)的NRTIs耐藥突變主要有M184V(11例)﹑K65R(2例)﹑TAMs-1(3例)﹑TAMs-2(1例)﹑L74V(1例)﹑Q151M復(fù)合體(2例)等。M184V位點(diǎn)耐藥突變由3TC﹑FTC選擇產(chǎn)生，可引起這兩種藥物的高水平耐藥，與其他突變合并出現(xiàn)時(shí)可中度降低ABC(阿巴卡韋)﹑DDI(去氧肌苷)的敏感性，在胸苷類似物組合中可延遲TAMs的出現(xiàn)，但可提高AZT﹑D4T和TDF等多種NRTIs的敏感性[14]。M184V位點(diǎn)突變耐藥發(fā)生率為29.7%(11/37)，是本次研究中NRTIs突變位點(diǎn)中發(fā)生率最高的。TAMs是胸腺嘧啶類似物(D4T﹑AZT)的選擇性突變，可引起全部NRTIs耐藥，其中TAMs-1比TAMs-2更為常見，可引起NRTIs更高水平的耐藥。

本次研究中HB072﹑HB165﹑HB289和HB319這4例患者均出現(xiàn)了TAMs突變和M184V突變，雖然M184V的出現(xiàn)可提高AZT的敏感性，但最終還是導(dǎo)致所有NNRTs產(chǎn)生了耐藥性?；颊逪B074和HB320出現(xiàn)了Q151M復(fù)合體突變(A62V﹑V75I﹑Fll6Y﹑F77L和Q151M)，突變過程中首先出現(xiàn)Q151M，之后其他4種位點(diǎn)突變迅速累積，使所有NRTIs耐藥性上升，造成AZT﹑DDI﹑D4T和ABC高水平耐藥，TDF和3TC中度水平耐藥。這兩例患者同時(shí)也出現(xiàn)了K65R突變，該突變可引起3TC﹑DDI﹑TDF﹑FTC和ABC等中度耐藥，但能夠提升AZT的敏感性。發(fā)生M184V和TAMs突變的患者HB289也產(chǎn)生了L74V突變，導(dǎo)致3TC﹑ABC﹑AZT﹑D4T﹑DDI﹑FTC﹑TDF不同程度耐藥。

本研究顯示，Y181C和K103N是NNRTIs最常見的耐藥突變，其發(fā)生頻率分別為29.7%(11/37)和13.5%(5/37)，不常見的耐藥突變有V108I 10.8%(4/37)﹑V179D/E 10.8%(4/37)﹑V106A 5.4%(2/37)﹑K101E 5.4%(2/37)等。K103N常由全部NNRTIs選擇產(chǎn)生，引起DLV﹑EFV﹑NVP高水平耐藥，而Y181C主要由NVP和DLV選擇產(chǎn)生并引起這兩種藥物的高水平耐藥和EFV低水平耐藥，并可導(dǎo)致ETR的敏感性降低，AZT和TDF的敏感性增加。NVP選擇產(chǎn)生的V108I﹑V106A﹑K101E和G190A突變會(huì)導(dǎo)致NNRTIs敏感性不同程度地降低，V108I單獨(dú)存在時(shí)沒有耐藥性，而與其他NNRTs共存時(shí)會(huì)導(dǎo)致EFV耐藥?；颊逪B167體內(nèi)的HIV-1基因同時(shí)發(fā)生了V106A和F227L突變，進(jìn)一步降低了NVP的敏感性。V179D/E和K103N同時(shí)存在會(huì)造成較高水平耐藥，但在本次研究中并未發(fā)現(xiàn)。

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