脂質體阿霉素和熱療對腦膠質瘤細胞的影響

史正華，張劍寧

脂質體阿霉素和熱療對腦膠質瘤細胞的影響

史正華，張劍寧

目的探討脂質體阿霉素和熱療對腦膠質瘤細胞的增殖抑制及凋亡誘導作用。方法體外培養(yǎng)人腦膠質瘤細胞SWO-38，采用水浴加溫法，觀察單純熱療、阿霉素化療、脂質體阿霉素化療、熱療+阿霉素化療、熱療+脂質體阿霉素化療對細胞增殖及凋亡的影響。MTT法確定阿霉素和脂質體阿霉素的工作濃度并檢測細胞增殖情況，流式細胞術檢測細胞凋亡情況。結果熱療+脂質體阿霉素化療組、熱療+阿霉素化療組的增殖抑制率分別為80.16%±3.78%、62.09%±3.05%，均顯著高于脂質體阿霉素化療組(40.27%±2.32%)、阿霉素化療組(30.56%±2.03%)、單純熱療組(16.51%±1.26%)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，且熱療+脂質體阿霉素化療組的增殖抑制率顯著高于熱療+阿霉素化療組(P＜0.05)。熱療+脂質體阿霉素化療組、熱療+阿霉素化療組的細胞凋亡率分別為84.19%±2.69%、60.29%±1.47%，均顯著高于脂質體阿霉素化療組(46.72%±2.09%)、阿霉素化療組(35.09%±1.46%)、單純熱療組(17.85%±0.78%)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，且熱療+脂質體阿霉素化療組的細胞凋亡率顯著高于熱療+阿霉素化療組(P＜0.05)。結論加熱可增強阿霉素及脂質體阿霉素對人腦膠質瘤細胞SWO-38的增殖抑制和凋亡誘導作用，且對脂質體阿霉素的增敏作用更強。

多柔比星；熱化療；細胞增殖；細胞凋亡

腦膠質瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的原發(fā)腫瘤，國內資料統(tǒng)計占顱內原發(fā)腫瘤的35.26%～60.96%，平均約為44.69%[1-2]。化療能延長部分膠質瘤患者的生存期，但效果欠佳。即使是相同病理類型和級別的膠質瘤患者，治療效果仍存在很大差異，治療方法的不同無疑是重要影響因素，但腫瘤內在的生物學特性，特別是分子水平的差異應該是關鍵所在[1,3,4]。另外，血-腦脊液屏障的存在，也使腦膠質瘤化療效果受到明顯影響。腫瘤熱療是繼手術、放療、化療、生物治療之后的一種新的腫瘤治療方法[5]。脂質體(liposome)多用做運載藥物的載體[6]，但普通脂質體進入體內后可被網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)所捕獲，在血循環(huán)中存在的時間較短，因而不易到達腫瘤區(qū)域，使其應用受到一定限制[7]。熱敏脂質體(thermosensitive liposomes，TSL)是在脂質體膜中加入一種熱敏性磷脂，在達到一定溫度時，脂質體膜的狀態(tài)發(fā)生改變，導致其通透性增加，使藥物大量釋放[8]，從而可明顯提高腫瘤組織內的藥物濃度。本研究觀察熱療及脂質體阿霉素對腦膠質瘤細胞SWO-38的殺傷作用，并進一步探討其對SWO-38細胞增殖及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 注射用鹽酸阿霉素(adriamycin，ADM)、脂質體阿霉素(liposomes-adriamycin，L-ADM)購自輝瑞制藥有限公司。Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組 人腦膠質瘤SWO-38細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，將培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每3～5d傳代1次，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。細胞分為對照組、單純熱療組、阿霉素化療組、脂質體阿霉素化療組、熱療+阿霉素化療組、熱療+脂質體阿霉素化療組，其中熱療時采用電熱恒溫水浴箱加熱，加熱溫度43℃，波動≤±0.1℃。

1.3 藥物工作濃度的確定 取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期SWO-38細胞，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液調整細胞密度為5×104/ml，接種于50ml的培養(yǎng)瓶中，將細胞分為對照組、單純熱療組、阿霉素化療組、脂質體阿霉素化療組、熱療+阿霉素化療組、熱療+脂質體阿霉素化療組，每組6個復孔，阿霉素及脂質體阿霉素濃度均分別設為0、2、4、6、8、10、12、14、16mg/L。對照組及化療組放在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，熱療組及熱療+化療組即刻放入電熱恒溫水浴箱中加熱相同時間(43℃ 1h)，然后放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h，以MTT法測定細胞增殖抑制率，以24h時間點的IC50作為實驗的工作濃度。

1.4 MTT法測定細胞增殖情況 取對數(shù)生長期的細胞，常規(guī)消化制成單細胞懸液，調整細胞密度為2.5×105/ml，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200μl， 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待細胞貼壁后，按1.3所述處理細胞(每組設6個復孔)，每孔加入5g/L MTT 20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h，取出培養(yǎng)板，棄去MTT液，每孔加入150μl DMSO，微量振蕩器上震蕩10min，然后將培養(yǎng)板置于全自動酶標儀上，在492nm波長處測定各孔的吸光度(A)值，計算細胞增殖抑制率。實驗重復3次。細胞增殖抑制率(%)=(對照組A值一實驗組A值)/對照組A值×100%。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況 每組收集5×105個細胞，用含2%牛血清白蛋白的PBS溶液洗滌2次，分別加入FITC標記的Annexin V和PI(操作按說明書進行)，避光放置1h，流式細胞儀檢測，每次讀取104個細胞。采用Cell Quest軟件進行數(shù)據(jù)分析，計算細胞凋亡率。

2 結 果

2.1 阿霉素及脂質體阿霉素工作濃度的確定 從圖1中可以看出，在相同濃度下，脂質體阿霉素對腦膠質瘤細胞的增殖抑制作用強于阿霉素。阿霉素IC50=8mg/L，脂質體阿霉素IC50=4mg/L，將其分別作為阿霉素及脂質體阿霉素的工作濃度。

圖1 不同濃度阿霉素、脂質體阿霉素對SWO-38細胞增殖率的影響Fig.1 Influence of different concentration of ADM and L-ADM on proliferation of SWO-38 cells

2.2 各組細胞增殖抑制率比較 SWO-38細胞經(jīng)單純熱療、阿霉素化療、脂質體阿霉素化療、熱療+阿霉素化療、熱療+脂質體阿霉素化療后，其增殖抑制率分別為16.51%±1.26%、30.56%±2.03%、40.27%±2.32%、62.09%±3.05%、80.16%±3.78%。統(tǒng)計學分析顯示，熱療+阿霉素化療組、熱療+脂質體阿霉素化療組、阿霉素化療組、脂質體阿霉素化療組的細胞增殖抑制率均明顯高于對照組(0%，P＜0.05)，且其余各組間比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.3 各組細胞凋亡率比較 SWO-38細胞經(jīng)單純熱療、阿霉素化療、脂質體阿霉素化療、熱療+阿霉素化療、熱療+脂質體阿霉素化療后，其細胞凋亡率分別為17.85%±0.78%、35.09%±1.46%、46.72%±2.09%、60.29%±1.47%、84.19%±2.69%。統(tǒng)計學分析顯示，熱療+阿霉素化療組、脂質體阿霉素化療組、阿霉素化療組、熱療+脂質體阿霉素化療組細胞凋亡率均顯著高于對照組(2.31%±0.21%，P＜0.05)，且其余各組間比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

3 討 論

膠質瘤是一類發(fā)病率高、危害性大的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，其典型臨床癥狀為顱內壓增高及瘤周腦組織受壓表現(xiàn)[9]。目前膠質瘤的治療以手術為主，放化療為輔，但傳統(tǒng)放化療缺乏特異性，在殺滅腫瘤細胞的同時也往往帶來明顯的毒副作用，而單純手術切除治療膠質瘤的中位生存期僅為52周[10]，因此有必要尋找新的有效的治療手段。

阿霉素是臨床常用的蒽環(huán)類抗腫瘤藥物，然而該藥在殺傷腫瘤細胞的同時，也會產(chǎn)生明顯的全身不良反應，如骨髓抑制、心臟損害等，因此臨床應用受到限制。近年來出現(xiàn)的脂質體阿霉素(liposome doxorubicin)既能加強藥物的抗癌作用，又能減少其毒副作用[11]。

熱敏脂質體的膜組成成分中有對溫度敏感的物質，當加熱到一定溫度時，脂質體膜的狀態(tài)發(fā)生改變，通透性增加，使藥物大量釋放。阿霉素熱敏脂質體在血液中循環(huán)時間長，能明顯降低肝臟和脾臟網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)對阿霉素的吞噬量，當在腫瘤病變部位局部加熱時，可促使阿霉素在腫瘤局部大量釋放并高度濃集，從而顯著抑制腫瘤生長[12]。

從本文的研究結果可以看出：熱療+化療后SWO-38細胞的增殖抑制率顯著高于單純熱療、單純化療，且熱療+脂質體阿霉素化療組明顯高于熱療+阿霉素化療組。熱療+化療后SWO-38細胞的凋亡率顯著高于單純熱療、單純化療，且熱療+脂質體阿霉素化療組明顯高于熱療+阿霉素化療組。該結果表明熱療與脂質體阿霉素聯(lián)合應用對腦膠質瘤細胞的抑制作用更強，一方面療效得到明顯提高，另一方面也可降低阿霉素的用量，減少毒副反應的發(fā)生。

腦膠質瘤的發(fā)病機制較為復雜，目前單一療法尚不能獲得理想的治療效果，只有通過多學科的共同協(xié)作，以多種治療方法進行優(yōu)勢互補及有機聯(lián)合，才能到達理想的效果，但熱療與脂質體阿霉素聯(lián)合應用治療腦膠質瘤的療效尚有待進一步臨床驗證。

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Effects of liposome-adriamycin (L-ADM) and thermotherapy on glioma cells: an experimental study

SHI Zheng-hua1, ZHANG Jian-ning2*
1Department of Neurosurgery, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, China
2Department of Neurosurgery, Navy General Hospital, Beijing 100048, China
*

, E-mail: jnhang2005@yahoo.com.cn

ObjectiveTo observe the effects of liposome-adriamycin (L-ADM) and thermotherapy on proliferation and apoptosis of SWO-38 glioma cells.MethodsThe SWO-38 glioma cells were cultivated in vitro. The effects of thermotherapy (43℃), ADM chemotherapy, L-ADM chemotherapy, thermotherapy + ADM chemotherapy, and thermotherapy + L-ADM chemotherapy on the cell proliferation and apoptosis were observed. The working concentration of ADM and L-ADM, and the cell proliferation rate were determined by MTT method. The apoptotic rate was determined by flow cytometry.ResultsThe proliferation inhibition rate of thermotherapy + L-ADM chemotherapy and thermotherapy + ADM chemotherapy was 80.16%±3.78% and 62.09%±3.05%, respectively, and it was significantly higher than that of L-ADM chemotherapy (40.27%±2.32%), ADM chemotherapy (30.56%±2.03%) or thermotherapy (16.51%±1.26%, P＜0.05), and the proliferation inhibition rate of thermotherapy + L-ADM chemotherapy was higher than that of thermotherapy + ADM chemotherapy (P＜0.05). The apoptotic rate of thermotherapy + L-ADM chemotherapy and thermotherapy + ADM chemotherapy was 84.19%±2.69% and 60.29%±1.47%, respectively, and it was significantly higher than that of L-ADM chemotherapy (46.72%±2.09%), ADM chemotherapy (35.09%±1.46%) and thermotherapy (17.85%±0.78%, P＜0.05), and the apoptotic rate of thermotherapy + L-ADM chemotherapy was higher than that of thermotherapy + ADM chemotherapy (P＜0.05).ConclusionThermotherapy can enhance proliferation inhibition and apoptosis induction effect of ADM and L-ADM on SWO-38 glioma cells, and this effect is even stronger with L-ADM.

doxorubicin; thermochemotherapy; cell proliferation; apoptosis

R739.410.53

A

0577-7402(2013)03-0201-03

2012-10-22；

2013-02-16)

(責任編輯：胡全兵)

史正華，碩士研究生。主要從事腦腫瘤方面的基礎與臨床研究

710032 西安 第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院神經(jīng)外科(史正華)；100048 北京 海軍總醫(yī)院神經(jīng)外科(張劍寧)

張劍寧，E-mail：jnzhang2005@yahoo.com.cn