IRX2基因在原發(fā)性肝癌中表達(dá)的初步研究

余爽，王靜，董冰，鮑依稀

原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)作為常見(jiàn)的惡性腫瘤，占腫瘤病死率的第三位，其發(fā)病率在東南亞和非洲最高，在中國(guó)每年約有23萬(wàn)人死于肝癌，占世界肝癌死亡人數(shù)的53%[1-3]。肝癌的發(fā)病機(jī)制仍不十分明確，其中涉及多個(gè)基因突變及表達(dá)異常[4-5]。

易洛魁族同源盒(iroquois homeobox，IRX)基因最早在果蠅的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育研究中被發(fā)現(xiàn)，編碼一個(gè)含高度保守同源盒序列的三氨基酸環(huán)延伸(three amino acid extension，TALE)超家族蛋白[6-7]。易洛魁家族有6個(gè)成員，IRX1－IRX6，它們又分兩簇，其中IRX1﹑IRX2與IRX4基因定位于5號(hào)染色體短臂5p15.33 位點(diǎn)或附近[8]，而IRX3﹑IRX5 和IRX6 基因定位于16 號(hào)染色體長(zhǎng)臂16q11.2－q13區(qū)域[9]。有研究顯示，IRX1基因參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展，可抑制胃癌細(xì)胞的增殖及侵襲[10]。Asaka等[11]報(bào)道IRX3基因在生存期較短的乳腺癌患者中的表達(dá)下降。IRX3在對(duì)雄激素不敏感的前列腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)也下調(diào)[12]。Lewis等[13]研究顯示IRX2基因與乳腺癌上皮細(xì)胞生長(zhǎng)和導(dǎo)管增殖有關(guān)。Rauch等[14]研究發(fā)現(xiàn)在肺鱗癌中12個(gè)CpG島中有85%以上發(fā)生甲基化，與其相關(guān)基因包括EVX2﹑IRX2等。IRX2基因作為易洛魁基因家族成員，屬同源盒基因，具有轉(zhuǎn)錄因子活性[15]。最近對(duì)這一基因家族功能的研究日漸增多，而國(guó)內(nèi)外尚無(wú) IRX2在肝癌中表達(dá)情況的報(bào)道。本研究通過(guò)檢測(cè)IRX2在肝癌組織與癌旁對(duì)照組織中的表達(dá)水平差異，探討IRX2在肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中所起的作用。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 收集2010年12月－2011年12月重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院及第二醫(yī)院手術(shù)切除肝癌組織標(biāo)本共51例。所有患者術(shù)前均未接受化療和放射治療。20例肝癌組織及癌旁組織標(biāo)本于手術(shù)后立即取材(離體20min內(nèi))放入液氮，隨后轉(zhuǎn)入–80℃低溫冰箱保存以備RNA及蛋白抽提。另外31例肝癌組織及相應(yīng)癌旁組織20例(11例缺乏相應(yīng)的癌旁組織)行常規(guī)4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，蘇木精-伊紅染色以備病理組織學(xué)分期。病理分期采用Edmondson-Steiner模式，詳細(xì)臨床特征如表1所示。

表1 51例肝癌組織標(biāo)本來(lái)源患者的臨床特征Tab. 1 Clinical characteristics of 51 patients with hepatocellular carcinoma

1.2 主要儀器試劑及檢測(cè)技術(shù) 定量PCR儀﹑Trans-blot 半干轉(zhuǎn)電泳槽﹑凝膠圖像分析系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad)。RNAiso Plus試劑﹑反轉(zhuǎn)錄試劑(日本TaKaRa)，Eva@green熒光染料(美國(guó)Bio-Rad)，PIRA裂解液(北京百泰克生物)，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒﹑化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)，DAB 顯色劑二抗(碧云天生物技術(shù)研究所)，β-actin(北京中山金橋)，IRX2抗體(Novus)。

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR) 取約80mg標(biāo)本，液氮研磨后加入 1ml RNAiso plus試劑，常規(guī)步驟提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后，將取得的cDNA于–20℃保存。以cDNA為模板，引物序列如下。IRX2-F：TCGTCTACGGATCACTCG，IRX2-R：CCTCCAGGTCGTCATTGTC。內(nèi)參照β-actin-F:CCACTGGCATCGTGATGG，β-actin-R:GCGGATGTCCACGTCACACT。使用Bio-Rad公司Eva@green熒光染料試劑進(jìn)行qRT-PCR相關(guān)操作，總反應(yīng)體系10μl。擴(kuò)增條件：95℃ 3min；95℃ 10s，55℃ 15s，72℃ 25s，共 39個(gè)循環(huán)；72℃7min，4℃暫停，目的基因與內(nèi)參照基因同時(shí)檢測(cè)，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，比較各組間的差異。

1.2.2 Western blotting檢測(cè) 收集組織標(biāo)本，與行qRT-PCR檢測(cè)的組織樣本相同。經(jīng)RIPA裂解，4℃，13 000r/min離心15min。取上清。測(cè)蛋白質(zhì)濃度，行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1h。一抗孵育(兔抗人IRX2多克隆抗體，Novus公司，1:500；鼠抗人β-actin多克隆抗體，北京中山金橋公司，1:1000)，4℃過(guò)夜，充分洗滌后加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h，充分洗滌后ECL顯色。記錄結(jié)果。

1.2.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 采用鏈菌素親生物素-過(guò)氧化酶連接法(SP)行免疫組化檢測(cè)，按說(shuō)明書(shū)操作，DAB顯色后觀察結(jié)果。高倍鏡下觀察結(jié)果，根據(jù)染色陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞胞核數(shù)目所占百分比計(jì)分，陰性為0分，陽(yáng)性細(xì)胞占1%～33%計(jì)1分，34%～66%計(jì)2分，占67%以上計(jì)3分；染色強(qiáng)度按腫瘤細(xì)胞胞核著色的深淺計(jì)分：無(wú)著色為0分，黃色計(jì)1分，淺棕色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分。最后計(jì)算兩項(xiàng)之和：0分為(–)，2～3分為(+/–)，4～5分為()，6～7分為()其中()和()為陽(yáng)性。

1.3 檢測(cè)標(biāo)本及指標(biāo)

1.3.1 肝癌及癌旁組織檢測(cè) 以20例肝癌組織與20例癌旁組織作為研究對(duì)象，采用qRT-PCR法檢測(cè)IRX2 mRNA的表達(dá)，采用Western blotting法檢測(cè)IRX2蛋白的表達(dá)。以所有31例肝癌組織及20例癌旁對(duì)照組織(其中11例缺乏相應(yīng)的癌旁組織)作為對(duì)象，采用免疫組化法觀察IRX2蛋白的表達(dá)情況。

1.3.2 肝癌組織檢測(cè) 取31例肝癌組織作為研究對(duì)象，采用免疫組化法檢測(cè)IRX2蛋白的表達(dá)情況；同時(shí)將此批肝癌組織按照病理分期分為高分化組(n=12)﹑中分化組(n=10)和低分化組(n=9)，分析3組癌組織IRX2蛋白的表達(dá)差異。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0進(jìn)行分析。分析IRX2 mRNA和蛋白的半定量結(jié)果為計(jì)量資料，由于不符合正態(tài)分布，采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析；分析IRX2蛋白在肝癌組織和癌旁組織以及不同分化程度肝癌組織中相對(duì)表達(dá)量的差異時(shí)，計(jì)數(shù)資料表示為患者例數(shù)，采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)進(jìn)行分析，多重比較采用K Independent Samples Test進(jìn)行。P＜0.05示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肝癌及癌旁組織檢測(cè)

2.1.1 IRX2 mRNA的表達(dá) 對(duì)20例肝癌組織與20例癌旁組織中IRX2基因表達(dá)量(以2–ΔΔCt表示)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示80%(16/20)的肝癌組織中IRX2基因表達(dá)量低于癌旁對(duì)照組，秩和檢驗(yàn)顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.04)。

2.1.2 IRX2蛋白的表達(dá)

2.1.2.1 Western blotting檢測(cè) 該檢測(cè)結(jié)果與qRTPCR所得結(jié)果一致，肝癌組織(n=20)中IRX2蛋白表達(dá)的半定量結(jié)果低于癌旁對(duì)照組(n=20)，相對(duì)表達(dá)量的值分別為0.866和1.803。經(jīng)秩和檢驗(yàn)證實(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.009，圖1)。

2.1.2.2 免疫組化 IRX2蛋白陽(yáng)性染色位于細(xì)胞核。在51例肝臟組織中，IRX2蛋白均呈陽(yáng)性表達(dá)(表2)，在31例肝癌組織和20例癌旁組織中，IRX2蛋白陽(yáng)性表達(dá)的組織分別為13例和20例，肝癌組織中IRX2蛋白的陽(yáng)性率低于癌旁對(duì)照組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000，秩和檢驗(yàn))。

2.2 肝癌組織 對(duì)31例不同分化程度的肝癌組織分析發(fā)現(xiàn)，IRX2蛋白陽(yáng)性染色表達(dá)在細(xì)胞核上，主要表現(xiàn)為粗糙深染的褐色顆粒。IRX2蛋白的表達(dá)量與腫瘤的分化程度相關(guān)，隨著肝癌組織分化程度的降低，陽(yáng)性表達(dá)也隨之降低(圖2)。

在31例肝癌組織中，12例高分化肝癌組織﹑10例中分化肝癌組織以及9例低分化肝癌組織的IRX2蛋白表達(dá)情況見(jiàn)表3，秩和檢驗(yàn)顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)；進(jìn)一步兩兩對(duì)比發(fā)現(xiàn)，高分化與低分化肝癌組織﹑中分化與低分化肝癌組織IRX2蛋白的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而中分化與高分化肝癌組織IRX2蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

圖1 Western blotting檢測(cè)肝癌組織和癌旁組織IRX2蛋白的表達(dá)Fig. 1 Expression of IRX2 protein in hepatocellular carcinoma tissue and paired normal tissue (Western blotting)

表2 IRX2 蛋白的表達(dá)情況[例(%)]Tab. 2 Expression of IRX2 protein [case(%)]

圖2 IRX2蛋白的表達(dá)(SP ×400)Fig. 2 Expression of IRX2 protein (SP×400)

3 討 論

IRX2基因是易洛魁基因家族中的成員，定位于5號(hào)染色體短臂5p15.33位點(diǎn)或附近[9]。文獻(xiàn)報(bào)道該區(qū)域存在IRX1﹑IRX2和EEl等3個(gè)候選基因。IRX1和IRX2屬于易洛魁基因家族成員，作為同源盒基因，與胚胎的前腸發(fā)育相關(guān)，具有轉(zhuǎn)錄因子活性[15]。癌變的細(xì)胞中同源盒基因功能可能丟失或活化；而同源盒基因IRX2與肝腫瘤發(fā)生的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究中，由于有11例肝癌組織未取到相應(yīng)合格的癌旁組織標(biāo)本，在檢測(cè)IRX2的表達(dá)差異中，僅20例的肝癌組織與其癌旁組織相對(duì)應(yīng)。qRT-PCR結(jié)果證實(shí)，HCC組中IRX2 mRNA的表達(dá)低于癌旁對(duì)照組織中的表達(dá)。為進(jìn)一步了解IRX2蛋白在HCC組和癌旁對(duì)照組的表達(dá)差異以及IRX2蛋白表達(dá)與HCC分化程度的關(guān)系，本研究采用Western blotting及免疫組化技術(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示IRX2蛋白主要位于細(xì)胞核，IRX2蛋白在HCC組中的表達(dá)低于癌旁對(duì)照組織。在分化程度越低，惡性程度越高的肝癌組織中，IRX2蛋白的表達(dá)量越低。

表3 IRX2蛋白在不同分化程度肝癌組織中的差異表達(dá)[例(%)]Tab. 3 Differentiated expression of IRX2 in hepatocellular carcinoma tissue at different histopathologic stages [case(%)]

有研究發(fā)現(xiàn)，許多抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG島甲基化后造成相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄障礙，導(dǎo)致細(xì)胞惡化[16-17]。DNA甲基化異常在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，可導(dǎo)致一種或多種抑癌基因沉默。隨著對(duì)易洛魁基因家族研究的深入，Rauch等[14]研究發(fā)現(xiàn)在肺鱗癌中，12個(gè)CpG島中有85%～100%發(fā)生甲基化，其中牽涉BARHL2﹑IRX2等基因。Kamalakaran等[18]在研究乳腺癌時(shí)發(fā)現(xiàn)CpG島在管狀A(yù)型乳癌的HOXA族和同源盒基因(IRX2﹑DLX2﹑NKX2-2)甲基化的發(fā)生明顯增加。

啟動(dòng)子調(diào)控mRNA轉(zhuǎn)錄數(shù)量并決定轉(zhuǎn)錄的組織特異性。有研究顯示，根據(jù)啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)特征將基因分為甲基化易感基因與甲基化抵抗基因，其中不斷進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的基因能間接防止CpG島的甲基化(如管家基因﹑MYC﹑FOS和CDK6等)，而呈限制性表達(dá)的基因容易發(fā)生甲基化(多為組織特異性基因，如同源盒類基因CDX2和IPF1等)。目前，去甲基化治療已成為腫瘤研究中的又一新領(lǐng)域。本課題組研究結(jié)果顯示IRX2在原發(fā)性肝癌組織中異常表達(dá)，提示IRX2可能與肝臟腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但是否與甲基化相關(guān)以及其具體機(jī)制并不完全清楚，本課題組將進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

[1] Zheng L, Liang P, Li J, et al. Expression of BC047440 protein in hepatocellular carcinoma and its relationship to prognosis[J].Chin J Cancer, 2010, 29(11): 931-936.

[2] Xu XB, Zhang XH, Yang MF, et al. Expression of PTPeta in human hepatocellular carcinoma tissue and SMMC7721 cells and its significance[J].Med J Chin PLA, 2012, 37(10): 970-973. [許小兵, 張曉華, 楊妙芳, 等. 肝細(xì)胞肝癌組織及細(xì)胞株中PTPeta的表達(dá)及意義研究[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2012,37(10): 970-973.]

[3] Wang R, Zhang M. Clinic significance of serum inflammatory factor detection in hepatitis B,hepatic cirrhosis and hepatic carcinoma[J]. Chin J Pract Intern Med, 2011, 31(6): 452-454.[王茸, 張淼. 乙型肝炎 肝硬化及肝癌血清中炎性因子檢測(cè)的臨床意義[J]. 中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志, 2011, 31(6): 452-454. ]

[4] Aravalli RN, Steer CJ, Cressman EN. Molecular mechanisms of hepatocellular carcinoma[J]. Hepatology, 2008, 48(6): 2047-2063.

[5] Marra M, Sordelli IM, Lombardi A, et al. Molecular targets and oxidative stress biomarkers in hepatocellular carcinoma: an overview[J]. J Transl Med, 2011, 10(9): 171.

[6] Dambly-Chaudière C, Leyns L. The determination of sense organs in Drosophila: a search for interacting genes[J]. Int J Dev Biol, 1992, 36(1): 85-91.

[7] Bürglin TR. Analysis of TALE superclass homeobox genes(MEIS, PBC, KNOX, Iroquois, TGIF) reveals a novel domain conserved between plants and animals[J]. Nucleic Acids Res,1997, 25(21): 4173-4180.

[8] Schmutz J, Martin J, Terry A, et al. The DNA sequence and comparative analysis of human chromosome 5[J]. Nature, 2004,431(7006): 268-274.

[9] Martin J, Han C, Gordon LA, et al. The sequence and analysis of duplication-rich human chromosome 16[J]. Nature, 2004,432(7020): 988-994.

[10] Guo X, Liu W, Pan Y, et al. Homeobox gene IRX1 is a tumor suppressor gene in gastric carcinoma[J]. Oncogene, 2010,29(27): 3908-3920.

[11] Asaka S, Fujimoto T, Akaishi J, et al. Genetic prognostic index influences patient outcome for node-positive breast cancer[J].Surg Today, 2006, 36(9): 793-801.

[12] Zhao H, Kim Y, Wang P, et al. Genome-wide characterization of gene expression variations and DNA copy number changes in prostate cancer cell lines[J]. Prostate, 2005, 63(2): 187-197.

[13] Lewis MT, Ross S, Strickland PA, et al. Regulated expression patterns of IRX-2, an Iroquois-class homeobox gene, in the human breast[J]. Cell Tissue Res, 1999, 296(3): 549-554.

[14] Rauch TA, Wang Z, Wu X, et al. DNA methylation biomarkers for lung cancer[J]. Tumour Biol, 2012, 33(2): 287-296.

[15] Becket Mb, Zulch A, Bos se A, et al. Irxl and Irx2 expression in early lung development[J]. Mech Devel, 2001, 106(1-2): 155-158.

[16] Yu Y, Chen LJ, Wang W. DNA methylation and tumor[J].Acta Acad Med CPAF, 2008, 17(4): 17-14. [俞媛, 陳立軍, 王偉. DNA甲基化與腫瘤的關(guān)系[J]. 武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2008,17(4): 17-14.]

[17] Cao J, Gao J, Du YQ. Aberrant methylation of NPTX2 in pancreatic carcinoma cell lines[J]. Med J Chin PLA, 2009,34(1): 18-20. [曹佳, 高軍, 杜奕奇. 胰腺癌細(xì)胞株中NPTX2基因的甲基化情況研究[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2009, 34(1):18-20.]

[18] Kamalakaran S, Varadan V, Giercksky Russnes HE, et al. DNA methylation patterns in luminal breast cancers differ from nonluminal subtypes and can identify relapse risk independent of other clinical variables[J]. Mol Oncol, 2011, 5(1): 77-92.