4.1蛋白家族成員merlin與ezrin在青海藏族胃癌中表達(dá)及對(duì)胃癌細(xì)胞功能的影響

蘇占海，楊生璽，王榮華，顧 燁，馬紅英，孔繁花

(青海大學(xué)1.醫(yī)學(xué)院生物教研室基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心;2.附屬醫(yī)院腫瘤放療科;3.醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，青海西寧810001)

因在其N端具有一保守結(jié)構(gòu)域FERM，ezrin(埃茲蛋白)、radxin(根蛋白)、moesin(膜突蛋白)和merlin(默林蛋白)同屬于4.1蛋白家族(4.1 protein family)［1－4］。Merlin 蛋白是抑癌基因神經(jīng)纖維瘤 2型基因 NF2(neurofibromatosis type 2 gene，NF2)的產(chǎn)物，其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及惡化具有相關(guān)性［5］。Merlin蛋白除扮演抑癌基因蛋白的功能外，還與ezrin蛋白參與調(diào)控細(xì)胞形態(tài)、黏附能力、細(xì)胞極化、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞骨架重組，同時(shí)也參與Rho、Rac和cdc42家族成員誘導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)途徑。研究發(fā)現(xiàn)ezrin蛋白在腫瘤中表達(dá)相對(duì)較高，提示ezrin蛋白與腫瘤的發(fā)生、侵襲等行為有關(guān)［6－12］。青海是我國胃癌高發(fā)地區(qū)，本研究擬探討merlin和ezrin在青海藏族胃癌組織中表達(dá)特點(diǎn)，及對(duì)胃癌細(xì)胞BGC-823增殖與黏附侵移的影響，最終為胃癌早期診斷、治療和胃癌發(fā)病分子機(jī)制提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 胃癌組織與正常胃黏膜組織的收集

收集2009年～2011年青海省人民醫(yī)院、青海大學(xué)附屬醫(yī)院藏族胃癌患者手術(shù)標(biāo)本，收集42例胃癌組織和37例正常胃黏膜組織;手術(shù)后病理檢查按WHO(2004年)分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。所有患者標(biāo)本(經(jīng)患者同意后)組織均從臨床手術(shù)后取材，甲醛固定、石蠟包埋，進(jìn)行病理學(xué)檢查和分析。

1.2 主要試劑

10X PBS緩沖液(生興生物公司)，0.01 mol/L pH 6.0檸檬酸鈉緩沖液、多聚體抗兔IgG-HRP二抗、Mayor's hematoxylin(博士德生物公司)，DBA染色試劑盒、組織及血樣DNA分離試劑盒、30%H2O2(博邁德公司)，兔ezrin一抗(Abcam公司)，免疫標(biāo)記試劑盒、Tween、二甲苯、DNA瓊脂糖、PCR純化試劑盒、青霉素/鏈霉素雙抗(10 g/L)(生工生物公司)，PCR Master Mix(Promega公司)，DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液(高糖)、胎牛血清(Invitrogen公司)，MTT(碧云天公司)。

1.3 PCR及DNA測(cè)序檢測(cè)外顯子突變

隨機(jī)選擇 NF2 基因外顯子 2、4，7、8、12、15 和17，設(shè)計(jì)其相應(yīng)引物，用于檢測(cè)其突變情況，外顯子引物羅列于表1。NF2各外顯子PCR反應(yīng)條件是95℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，55～60℃復(fù)性30～60 s，72℃延伸 40～90 s，共 35個(gè)循環(huán)，最后72℃ 5～8 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)試劑盒純化后，送上海生工生物公司進(jìn)行測(cè)序。NF2外顯子PCR擴(kuò)增引物見表1。

1.4 Western blot蛋白印跡法

將目的細(xì)胞培養(yǎng)液吸干后，立刻加入NP-40溶液裂解細(xì)胞，提取并收集蛋白，用相應(yīng)的 Western blot緩沖液處理后，將樣品在99℃變性5 min，之后上樣于12%聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)進(jìn)行分析，將蛋白轉(zhuǎn)膜到 PVDF膜上，并用相應(yīng)的一抗(1∶800稀釋)和二抗(1∶250稀釋)進(jìn)行處理，最終對(duì)膜上的蛋白進(jìn)行Luminisence標(biāo)記后進(jìn)行觀察。

1.5 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖

將對(duì)數(shù)生長期胃癌細(xì)胞BGC-823以1×105/mL均勻接種于96孔培養(yǎng)板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)立空白對(duì)照組。24 h培養(yǎng)后，利用Lipofectamine 2000將100 μg/L重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)。共接種5塊培養(yǎng)板，分別培養(yǎng)相應(yīng)的時(shí)間段。按照設(shè)定時(shí)間段將5 g/LMTT溶液20 μL加入，37 ℃ 培養(yǎng)4 h，之后加入150 μL DMSO，震蕩混勻10 min，在酶標(biāo)儀波長492 nm處檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 NF2外顯子PCR擴(kuò)增引物Table 1 NF2 exons primer for PCR

1.6 細(xì)胞黏附侵移實(shí)驗(yàn)

基底膜基質(zhì)包埋的96-孔板被用于細(xì)胞基質(zhì)黏附能力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，首先加入50 μL未含胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，并在37℃孵育30 min，然后將300 μL細(xì)胞懸浮液(1×105cells/mL)接種于板中，培養(yǎng)12 h后利用Lipofectamine 2000進(jìn)行重組質(zhì)粒pcDNA3.1+FERM、pcDNA3.1+-merlin-1、pcDNA3.1+merlin-2和pcDNA3.1+ezrin以及對(duì)照載體pcDNA3.1+轉(zhuǎn)染，并將細(xì)胞在37℃分別培養(yǎng) 6、12、24和48 h，然后利用MTT方法檢測(cè)細(xì)胞黏附能力，對(duì)照組用空質(zhì)粒載體pcDNA3.1+轉(zhuǎn)染。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 NF2外顯子在青海藏族胃癌組織中突變檢測(cè)

隨機(jī)選擇 NF2 基因外顯子 2、4、7、8、12、15 和17進(jìn)行PCR及DNA測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在merlin蛋白基因NF2外顯子17中發(fā)現(xiàn)突變，具體基因型為第405處堿基 T處發(fā)生 C/C、C/T型基因型;第1259處堿基C位發(fā)現(xiàn)T/T、C/T基因型(表2，圖1，2)。

2.2 青海藏族胃癌組織和正常胃黏膜組織中ezrin蛋白表達(dá)檢測(cè)

在藏族族正常胃黏膜組織中，ezrin蛋白不表達(dá)或者表達(dá)很低(圖3A)，但是在胃癌組織中ezrin蛋白表達(dá)明顯增加(圖3B，C，D)(P＜0.05)。

表2 青海藏族胃癌組織NF2基因外顯子2、4、7、8、12、15和17突變檢測(cè)Table 2 Mutation summary in exon 2，4，7，8，12，15 and 17 of NF2 gene in Tibetan gastric cancer

表3 Ezrin蛋白在藏族胃癌及正常胃黏膜組織中表達(dá)Table 3 Ezrin expression in normal gastric mucosa and cancer of Qinghai Tibetan patients

在青海藏族胃癌患者中ezrin蛋白表達(dá)與組織學(xué)分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及胃癌分化程度(高、中分化與低分化比較)有明顯差異性(P＜0.05)(表4)。

2.3 Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒效率檢測(cè)

Merlin-1、-2和 ezrin轉(zhuǎn)染效果良好，間接驗(yàn)證Lipofectamine 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染的效果良好，F(xiàn)ERM結(jié)構(gòu)域因無單獨(dú)抗體而無法直接檢測(cè)(圖4)。吸光度值(目標(biāo)蛋白/β-actin)也顯示出3種基因轉(zhuǎn)染后表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定(圖5)。

2.4 FERM、merlin-1、-2和ezrin蛋白對(duì)胃癌細(xì)胞增殖影響的分析

和對(duì)照組相比FERM、merlin-2蛋白對(duì)胃癌細(xì)胞BGC-823的增殖沒有影響，而merlin-1和ezrin蛋白在48 h后對(duì)胃癌細(xì)胞具有一定抑制作用，其中抑癌基因蛋白merlin-1對(duì)胃癌增殖的抑制較為明顯 (圖6)(P ＜0.05)。

2.5 FERM、merlin-1、-2和ezrin對(duì)胃癌細(xì)胞侵移影響的檢測(cè)

圖3 Ezrin蛋白在青海藏族胃癌組織和正常胃黏膜組織中表達(dá)Fig 3 Immunohistochemical staining of ezrin protein expression in gastric cancer and normal gastric mucosa of Qinghai Tibetan patients(×400)

表4 Ezrin蛋白表達(dá)與青海藏族胃癌患者臨床特征及病理關(guān)系Table 4 The relationship between ezrin expression and clinic characteristics of gastric patients

根據(jù)細(xì)胞基質(zhì)黏附能力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，胃癌細(xì)胞BGC-823轉(zhuǎn)染FERM、merlin-1、-2和ezrin重組質(zhì)粒24 h后顯示，merlin-1蛋白對(duì)胃癌細(xì)胞BGC-823的黏附能力具有抑制作用(P＜0.05)(圖7)，而FERM結(jié)構(gòu)域、ezrin及merlin-2蛋白對(duì)胃癌細(xì)胞黏附能力沒有明顯作用。

圖6 FERM、merlin-1、-2 and ezrin蛋白對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響Fig 6 The effects of FERM、merlin-1，-2 and ezrin on the gastric cancer proliferation，n=5)

3 討論

Merlin和ezrin蛋白共享其N-端結(jié)構(gòu)域FERM，均參與細(xì)胞極化、細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞增殖和細(xì)胞形態(tài)改變等功能。其中，而merlin蛋白存在兩種主要異構(gòu)體，即merlin-1和merlin-2。Merlin-1和-2在其3-末端因NF2基因轉(zhuǎn)錄結(jié)果不同而導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)與功能的差異。其次，對(duì)蛋白功能研究發(fā)現(xiàn)，merlin-1作為抑癌基因蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖具有抑制作用，而merlin-2蛋白沒有類似的抑制作用，但是具體作用機(jī)制并未被闡明清楚［5－6，12］。

在前期研究中發(fā)現(xiàn)，merlin蛋白在青海藏族胃癌組織中表達(dá)水平比正常胃黏膜組織中高，且其表達(dá)與腫瘤分化程度、組織學(xué)分型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究結(jié)果顯示在外顯子17第405位和1 259位處分別發(fā)現(xiàn)突變，兩個(gè)位點(diǎn)突變率分別為71.4%和59.5%。免疫組化結(jié)果顯示，ezrin蛋白在青海藏族胃癌組織中表達(dá)比正常胃黏膜組織中較高，且ezrin蛋白表達(dá)與組織學(xué)分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及胃癌分化程度 (高、中分化與低分化比較)具有明顯差異性。因此，merlin和ezrin蛋白在青海藏族胃癌組織中的相對(duì)高表達(dá)，可能與胃癌易感性具有一定相關(guān)性。

圖7 FERM、merlin-1、-2 and ezrin蛋白對(duì)胃癌細(xì)胞黏附能力的影響Fig 7 The effects of FERM，merlin-1，-2 and ezrin on the gastric cancer adhesion ability，n=5)

本研究發(fā)現(xiàn)，抑癌基因蛋白merlin-1和ezrin蛋白對(duì)胃癌細(xì)胞BGC-823增殖具有抑制作用，且merlin-1對(duì)胃癌細(xì)胞抑制能力更強(qiáng)，而FERM和merlin-2蛋白對(duì)胃癌細(xì)胞增殖無明顯影響。同時(shí)，merlin-1對(duì)胃癌細(xì)胞BGC-823的黏附能力具有抑制作用，而FERM結(jié)構(gòu)域、ezrin及merlin-2蛋白對(duì)胃癌細(xì)胞黏附能力沒有明顯作用，推測(cè)FERM結(jié)構(gòu)域主要功能是連接肌動(dòng)蛋白與質(zhì)膜的重要結(jié)構(gòu)，而對(duì)細(xì)胞增殖與黏附或侵移的調(diào)節(jié)作用極小或沒有。Merlin-2雖和merlin-1同屬NF2產(chǎn)物，但是由于其在3-端結(jié)構(gòu)的不同，且沒有抑癌基因蛋白功能，因此推測(cè)其C端結(jié)構(gòu)域?qū)ζ渥陨砉δ艿膶?shí)施起較為重要的作用。雖然ezrin蛋白顯示其具有一定抑制胃癌細(xì)胞增殖功能，但對(duì)胃癌黏附侵移能力并沒有抑制作用。因此ezrin在青海藏族胃癌組織中高表達(dá)，可能使得ezrin通過參與對(duì)細(xì)胞骨架重組、極化和細(xì)胞侵移的調(diào)節(jié)作用，從而影響胃癌細(xì)胞的侵移方向、細(xì)胞形態(tài)改變及侵移能力。綜上所述，通過檢測(cè)胃癌組織中merlin-1和ezrin蛋白表達(dá)水平，或許對(duì)了解胃癌發(fā)展和轉(zhuǎn)移程度，以及為之后的治療、診斷和手術(shù)提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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