GATA-4過表達(dá)增加大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞

李紅霞，周亞峰，楊向軍，蔣文平

(蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇蘇州215006)

細(xì)胞移植治療為不可逆性心臟疾病提供了全新的治療策略，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，MSCs)由于其高度的擴(kuò)增能力和向心肌細(xì)胞分化的潛能，成為治療各種不可逆性心臟疾病的一個全新的選擇［1］。研究發(fā)現(xiàn)，MSCs通過5-氮胞苷誘導(dǎo)或心肌細(xì)胞共培養(yǎng)等方法均可分化為心肌樣細(xì)胞［2－3］，但其心肌細(xì)胞分化率低。GATA-4是GATA鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子家族中一員，該因子是心臟前體細(xì)胞的最早期標(biāo)志之一，是心臟細(xì)胞分化、發(fā)育過程中的重要轉(zhuǎn)錄因子。研究發(fā)現(xiàn)，GATA-4可以促進(jìn)P19胚胎癌性細(xì)胞系向心肌分化［4］。最近報道也顯示，轉(zhuǎn)染了Wnt11真核表達(dá)質(zhì)粒的MSCs(MSCWnt11)與心肌細(xì)胞(CM)共培養(yǎng)后，能顯著促進(jìn)MSCs向心肌分化;而用GATA-4-siRNA敲除MSCWnt11中GATA-4的活性后，心肌分化明顯降低［5］?？梢奊ATA-4對于MSCs的心肌分化起著至關(guān)重要的作用。

本實(shí)驗將GATA-4基因轉(zhuǎn)染MSCs或與CM共培養(yǎng)兩種方法進(jìn)行體外誘導(dǎo)，觀察GATA-4基因轉(zhuǎn)染MSCs后分化為心肌細(xì)胞及表達(dá)心肌細(xì)胞特異性標(biāo)記物BNP、Islet-1和α-actinin的能力，為今后進(jìn)一步研究MSCs分化的機(jī)制以及應(yīng)用于臨床移植治療急性心肌梗死等心肌疾病提供充分的理論依據(jù)和技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與動物

清潔級Sprague-Dawley(SD)大鼠，體質(zhì)量180～200 g，雌雄不限，由蘇州大學(xué)試驗動物中心提供(合格證號:syxk蘇 2007-0035)，用于分離培養(yǎng)MSCs。同種新生1～3 d乳鼠，用于分離和培養(yǎng)CM。胰蛋白酶、IMDM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清 (Gibco公司)，兔抗 GATA-4多克隆抗體和anti-brain natriuretic peptide(BNP)抗體(Abcam公司)，小鼠抗α-actinin單克隆抗體和小鼠抗Islet-1單克隆抗體 (Santa Cruz公司)，抗 β-actin(Cell Signaling公司);Fugene6轉(zhuǎn)染試劑盒(Roche公司)，原代心肌細(xì)胞分離試劑盒(Washington公司)。核蛋白提取試劑盒 (Thermo Scientific公司)。常規(guī)生化試劑為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 MSCs體外分離、培養(yǎng)及純化:參考文獻(xiàn)［6］。即無菌條件下，用含20%FBS的IMDM從大鼠股骨和脛骨髓腔中沖洗骨髓細(xì)胞，離心、棄上清得細(xì)胞沉淀。在細(xì)胞沉淀中加入20%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的IMDM，接種并置37℃、5%CO2飽和濕度的CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，兩天后換液，棄掉未貼壁造血細(xì)胞，以后每3～4天更換培養(yǎng)基1次，細(xì)胞達(dá)80%匯合后胰蛋白酶消化，1∶3傳代擴(kuò)增純化。3～5代細(xì)胞用于實(shí)驗。用流式細(xì)胞儀檢測CD90(干細(xì)胞表面標(biāo)志)和CD45(白細(xì)胞分化抗原)的表達(dá)。

1.2.2 新生大鼠CM培養(yǎng)及純化:使用Washington心肌細(xì)胞分離試劑盒，按照說明書操作。簡言之，無菌條件下取出1～3 d大鼠心臟，取心室并剪碎，加入胰蛋白酶消化，4℃過夜。次日加胰蛋白酶抑制劑終止消化，然后加膠原蛋白酶，于振蕩器上37℃振蕩40 min，收集細(xì)胞沉淀，然后接種于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM中。培養(yǎng)2 h后，將懸浮細(xì)胞重新接種、培養(yǎng)，次日換液。

1.2.3 GATA-4基因轉(zhuǎn)染 MSCs:GFP(對照)、GATA4-GFP質(zhì)粒為本實(shí)驗前期構(gòu)建于反轉(zhuǎn)錄表達(dá)系統(tǒng) (pMSCV)。參考方法［7］，用Fugene6轉(zhuǎn)染試劑盒(Roche公司)按照說明書轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞GP2-293，收集培養(yǎng)上清;用無菌、0.45 μm醋酸纖維素濾器過濾，替換MSCs的培養(yǎng)基，加入聚凝胺10 mg/L提高轉(zhuǎn)染率。轉(zhuǎn)染后的MSCs加入嘌呤霉素來篩選陽性細(xì)胞。熒光顯微鏡下觀察GFP綠色熒光。對照組為只轉(zhuǎn)染GFP沒有目的基因的空質(zhì)粒細(xì)胞(MSCNull)，MSCGATA-4轉(zhuǎn)染組為轉(zhuǎn)染GFP和GATA-4的細(xì)胞。

1.2.4 GATA-4基因在MSC中表達(dá)及鑒定:通過Real-time PCR、Western blot和免疫熒光組織化學(xué)分析檢測GATA-4的表達(dá)

Real-time PCR測定GATA-4的mRNA表達(dá):用Trizol試劑從培養(yǎng)的 MSCNull和 MSCGATA-4提取總RNA，酶標(biāo)儀定量。將相等量的RNA樣品反轉(zhuǎn)錄cDNA，再經(jīng)定量 PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系共25 μL:cDNA 1 μL，上下游引物各0.5 μL，dNTP 1 μL，Taq DNA 聚合酶0.5 μL，MgCl2緩沖液2.5 μL，SYBR Green 2 μL和 ddH2O 17 μL。反應(yīng)條件:變性95 ℃、15 min;擴(kuò)增 45 個循環(huán)94℃、15 s，55℃、30 s，72℃、15 s;熔解曲線72℃至95℃、0.1℃/s。經(jīng)分析系統(tǒng)進(jìn)行相關(guān)表達(dá)的定量，引物序列見表1。

Western blot測定GATA-4蛋白的表達(dá):收集培養(yǎng)MSCNull和MSCGATA-4細(xì)胞，按照試劑盒說明書提取核蛋白。相等量核蛋白60 μg行12%丙烯酰胺凝膠電泳，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗4℃封閉過夜，HRP標(biāo)記二抗室溫封閉2 h。洗膜后用ECL試劑盒(GE Healthcare)發(fā)光，吸光度分析法定量。

免疫熒光組織化學(xué)分析:預(yù)先培養(yǎng)細(xì)胞在玻片上，PBS洗1次，甲醛溶液固定細(xì)胞15 min;清洗2次;丙酮處理細(xì)胞10 min，洗3次。10%血清室溫封閉細(xì)胞30 min。加封閉液配置的抗GATA-4的一抗(1∶50)70 μL，37 ℃ 濕盒孵育1 h;洗 3 次。加封閉液配置的二抗100 μL，37℃濕盒孵育1 h;洗4次，風(fēng)干。滴加含DAPI的熒光增強(qiáng)劑后封片，熒光顯微鏡下觀察攝像。

1.2.5 MSC與CM體外共培養(yǎng)實(shí)驗:采用嵌套式共培養(yǎng)［2］:CM 接種在孔徑為3 μm聚碳酸酯膜分開的Transwell?嵌套培養(yǎng)皿的上層，而MSCs接種于下層。Ⅰ組:MSCNull與CM共培養(yǎng)組(對照組);Ⅱ組:MSCGATA-4與 CM共培養(yǎng)組。分別消化 MSCNull與MSCGATA-4，吹打成細(xì)胞懸液，按1×105個/mL接種于6孔板;與培養(yǎng)第3天的CM按細(xì)胞數(shù)量1∶2混勻，進(jìn)行共培養(yǎng)。共培養(yǎng)1周后，收集下層MSC，提取總RNA和總蛋白，分別做實(shí)時定量PCR和Western blot分析，檢測不同組MSC的心肌特異蛋白BNP、Islet-1和α-actinin的mRNA和蛋白的表達(dá)，從而鑒定MSCGATA-4心肌分化能力。Real-time PCR和Western blot的方法同上，引物序列見表1。

采用混合共培養(yǎng)［2］:MSC和CM按細(xì)胞數(shù)量1∶10混合共培養(yǎng)，Ⅰ組:MSCNull與 CM共培養(yǎng)組(對照組);II組:MSCGATA-4與CM共培養(yǎng)組。混合共培養(yǎng)1周后，用熒光顯微鏡下觀察MSCs，并用免疫組化檢測α-actinin的表達(dá)。另外用0.25%的胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，制成含有1.0×106個/mL MSCs的單細(xì)胞懸液，用流式細(xì)胞儀檢測α-actinin的陽性率，從而檢測GATA-4對MSCs的心肌分化率的影響。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

表1 引物的序列Table 1 The sequence of primers

2 結(jié)果

2.1 乳鼠心肌細(xì)胞的一般特征

心肌細(xì)胞在分離培養(yǎng)后4～6 h貼壁生長，相互有偽足交聯(lián)，但不融合。20 h后可見單個細(xì)胞的搏動，搏動頻率 42～78 beat/min。至72 h時，可見細(xì)胞伸出偽足交織成網(wǎng)，形成細(xì)胞簇，呈放射排列的同心圓狀，搏動同步性，收縮明顯，搏動頻率50～100 beat/min。免疫組化顯示95%以上細(xì)胞為α-actinin陽性(圖1)。

圖1 培養(yǎng)的心肌細(xì)胞α-actinin染色Fig 1 α-actinin staining of cultured CM(×200)

2.2 MSCs體外培養(yǎng)及表面抗原的表達(dá)

MSCs分離后約24 h貼壁，2～3 d細(xì)胞開始匯合，5～7 d匯合達(dá)80%。消化傳代細(xì)胞增殖更加迅速，4～6 d可長滿整個瓶底。隨著換液與傳代，MSCs逐漸得到純化。第3代細(xì)胞生長均勻一致，方向較規(guī)律，呈平行或旋渦狀生長。用流式細(xì)胞儀檢測MSCs表面抗原特性，MSCs表達(dá)CD90，其陽性率達(dá)95%;不表達(dá)CD45。

2.3 MSCs轉(zhuǎn)染GATA-4的表達(dá)

GATA-4轉(zhuǎn)染MSCs后，在熒光顯微鏡下，細(xì)胞成綠色熒光(圖2)，轉(zhuǎn)染效率達(dá)到98%以上。MSCGATA-4的細(xì)胞核GATA-4表達(dá)陽性，細(xì)胞核呈現(xiàn)紅色熒光(圖3A)，而對照組(MSCNull)雖然細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，但細(xì)胞核的 GATA-4表達(dá)陰性(圖 3B)。MSCGATA-4組GATA-4 mRNA的表達(dá)明顯高于對照組MSCNull(圖4A)(P＜0.05)。MSCGATA-4組 GATA-4蛋白的表達(dá)明顯高于對照組MSCNull(圖4B)(P＜0.05)?？梢奊ATA-4成功轉(zhuǎn)染到MSCs中。

2.4 MSCs與CM共培養(yǎng)后心肌基因的表達(dá)

單獨(dú)培養(yǎng)MSC，GATA-4組與對照組相比，心肌細(xì)胞標(biāo)記基因BNP、α-actinin和Islet-1有所增加。當(dāng)MSC與 CM嵌套共培養(yǎng)1周后，BNP、α-actinin和Islet-1的表達(dá)在MSCGATA-4中明顯高于對照組(P＜0.05)(圖5A)。通過Western blot分析蛋白(圖5B)，發(fā)現(xiàn)BNP、α-actinin和Islet-1的蛋白表達(dá)在MSCGATA-4組中也明顯高于對照組(P＜0.05)(圖5C)。

2.5 MSCs與CM混合共培養(yǎng)后心肌分化

MSCs與CM混合共培養(yǎng)1周后，熒光顯微鏡下可見搏動的 MSCs，搏動的細(xì)胞數(shù) MSCGATA-4組(26% ±3%)明顯高于對照組MSCNull(14% ±1%)。用免疫組化染色可見部分MSCsα-actinin染色陽性。用流式細(xì)胞儀檢測 α-actinin準(zhǔn)確表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MSCGATA-4組(34% ±4%)明顯高于對照組 MSCNull(14% ±1%)(P＜0.05)?？梢奙SCGATA-4組心肌分化率明顯高于對照組。

3 討論

GATA-4是GATA鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子家族中一員，該因子是心臟前體細(xì)胞的最早期標(biāo)志之一，是心臟細(xì)胞分化、發(fā)育過程中的重要轉(zhuǎn)錄因子;在心臟生長發(fā)育、分化、心肌肥厚和抗凋亡等方面發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。GATA-4作為一種特定的細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子，涉及基因調(diào)節(jié)的不同環(huán)節(jié);控制著基因的表達(dá)和功能的調(diào)節(jié)。它可以調(diào)控許多心臟結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，包括ANP、BNP、α-MHC等。另外它可以通過其鋅指結(jié)構(gòu)與其他心臟特異性的轉(zhuǎn)錄因子如Nkx2.5、TBX5、MEF2等相互作用形成復(fù)合物發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，從而調(diào)節(jié)心臟發(fā)育。

近年有研究證實(shí)，GATA-4直接或間接地在心肌梗死修復(fù)中扮演著重要的調(diào)節(jié)作用［8］。它可以促進(jìn)血管生成，增加細(xì)胞存活和分化［8－10］。在1997年Grepin C報道，在 P19胚胎癌性細(xì)胞系中，GATA-4過度表達(dá)可以促進(jìn)其向搏動的心肌細(xì)胞分化，而用反義寡核苷酸抑制GATA-4因子的表達(dá)，則可阻斷心肌細(xì)胞分化?？梢奊ATA-4可以促進(jìn)P19胚胎癌性細(xì)胞系向心肌分化。對GATA-4的乙?；揎棧部缮险{(diào)心肌細(xì)胞特異性基因的表達(dá)。本研究人員最近發(fā)現(xiàn)［7］，轉(zhuǎn)染了GATA-4真核表達(dá)質(zhì)粒的MSCs，能顯著促進(jìn)MSCs釋放生長因子如VEGF和IGF;增加人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC的生長，促進(jìn)毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)的形成，在此實(shí)驗的基礎(chǔ)上，研究人員進(jìn)一步研究了GATA-4對MSCs的促心肌分化作用。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染GATA-4基因后，把轉(zhuǎn)基因的MSCs與新生大鼠CM共培養(yǎng)7 d，MSCGATA-4心肌基因BNP、Islet-1、α-actinin的mRNA表達(dá)與對照組相比明顯增加。用Western blot檢測發(fā)現(xiàn)BNP、Islet-1和α-actinin蛋白表達(dá)也明顯增加。當(dāng)把轉(zhuǎn)基因的MSCs與新生大鼠CM混合共培養(yǎng)7 d后，發(fā)現(xiàn)MSCGATA-4的搏動增加，α-actinin免疫組化染色也增加。用流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)MSCGATA-4組α-actinin的陽性率明顯增加?？梢奙SCGATA-4組的心肌分化率高于對照組。這些結(jié)果提示，與對照組比較，轉(zhuǎn)染了GATA-4后可以明顯增加MSCs轉(zhuǎn)化為心肌樣細(xì)胞，促進(jìn)MSCs向心肌分化。這為尋找更有效的MSCs治療方案提供理論和實(shí)驗依據(jù)，為不可逆性心臟疾病的生物學(xué)治療開辟新的途徑。

總之，細(xì)胞移植在心血管疾病組織工程研究中應(yīng)用前景廣闊，但細(xì)胞的分化是一個非常復(fù)雜的過程。該研究將有助于人們更好地認(rèn)識GATA-4對MSCs調(diào)節(jié)作用及心肌分化作用，其具體機(jī)制還需進(jìn)一步探討。這將為研究MSCs分化的機(jī)制并應(yīng)用于臨床移植提供充分的理論依據(jù)。

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