人骨髓間充質(zhì)細(xì)胞腦內(nèi)移植治療食蟹猴腦缺血

朱 華，馮 銘，盧 珊，李 秦，劉 穎，安沂華，趙春華，王任直，秦 川*

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院1.比較醫(yī)學(xué)中心衛(wèi)生部比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所Motac合作實(shí)驗(yàn)室，北京100021;3.北京協(xié)和醫(yī)院，北京100730;4.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京100005;5.北京神經(jīng)外科研究所，北京100039)

缺血性腦卒中在腦血管病的發(fā)病率居首位［1］，是由各種原因誘發(fā)腦血管栓塞引起的腦組織缺血、缺氧，進(jìn)一步誘發(fā)腦神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死，最終導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙和功能喪失的一類疾病。目前針對(duì)缺血性腦血管病的治療主要是手術(shù)和溶栓，效果比較明顯。但由缺血誘發(fā)的神經(jīng)細(xì)胞變性壞死而導(dǎo)致的神經(jīng)功能障礙卻沒有很好的治療方法。傳統(tǒng)認(rèn)為神經(jīng)細(xì)胞難以再生，干細(xì)胞的出現(xiàn)改變了人們的觀點(diǎn)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)具有多分化潛能，特性穩(wěn)定，獲取方便，易于分離、培養(yǎng)及鑒定，在體外培養(yǎng)多代后仍能保持多向分化潛能。已有大量研究證實(shí)BMSCs可明顯改善嚙齒類腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ偷呐R床癥狀［2－4］，但未見以人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow-derived mesenchymal stem cells，hBMSCs)治療非人靈長(zhǎng)類腦缺血模型的報(bào)道。本研究在建立穩(wěn)定食蟹猴腦缺血模型的基礎(chǔ)上，對(duì)腦內(nèi)移植hBMSCs的效果進(jìn)行系統(tǒng)觀察和評(píng)價(jià)，為臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年雄性食蟹猴18只，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)【SCXK-(軍)2007-005】，年齡4～6歲，體質(zhì)量4.2～4.5 kg。

1.2 腦缺血模型的制作

使用光化學(xué)法建立腦缺血模型，具體方法見參考文獻(xiàn)［5］。

1.3 干細(xì)胞治療

hBMSCs由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所趙春華教授提供。

1.3.1 動(dòng)物分組:18只動(dòng)物分為模型組(CG)，干細(xì)胞移植高劑量組(5×106，HDG)和低劑量組(1×106，LDG)，每組6只。移植的時(shí)間窗為造模后4周。

1.3.2 細(xì)胞注射:細(xì)胞為250 μL無色懸液，5個(gè)移植途徑，每點(diǎn)移植量為50 μL，移植速度10 μL/min。對(duì)照組等體積0.9%氯化鈉注射液。

1.4 移植效果的評(píng)價(jià)

1.4.1 行為學(xué):神經(jīng)功能評(píng)分:使用文獻(xiàn)［6］中的方法在造模后1及3 d和1、2、3及4周及干細(xì)胞注射后1 及3 d和1、2、3、4、5、6 及 8 周對(duì)動(dòng)物的神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分。精準(zhǔn)上肢運(yùn)動(dòng)測(cè)試:按照參考文獻(xiàn)［7］中的方法在造模后1及3 d和1、2、3及4周及干細(xì)胞注射后1 及3 d和1、2、3、4、5、6 及8 周采集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.4.2 影像學(xué):1)頭顱MRI掃描:造模后24 h，以后每2周1次進(jìn)行MRI檢查，觀察干細(xì)胞植入后動(dòng)物腦部缺血灶形態(tài)和大小變化;儀器型號(hào):Philips Intera Achiva 3.0T磁共振儀。2)18F－FDG-PET頭顱掃描:造模后24 h，以后每2周1次進(jìn)行PET掃描。觀察梗死周圍能量代謝情況。選擇梗死最明顯的層面為感興趣區(qū)，測(cè)定缺損區(qū)域的最低標(biāo)準(zhǔn)攝取值(Standardized Uptake Value，SUV)，計(jì)算 SUV%(SUV%= 同側(cè)SUVX100%/對(duì)側(cè)相應(yīng)區(qū)域 SUV)。儀器:Siemens ECAT EXACT HR+型高分辨PET儀。所用18FFDG為北京協(xié)和醫(yī)院PET中心自行生產(chǎn)。

1.4.3 組織病理學(xué)檢查:1)組織處理:干細(xì)胞移植后2和12周每組分別處死動(dòng)物3只動(dòng)物，參照文獻(xiàn)［10］的方法取材。標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛固定、石蠟包埋切片、蘇木素-伊紅(H.E)染色。2)梗死面積的測(cè)定:用AperioGL全自動(dòng)數(shù)字病理切片掃描系統(tǒng)并計(jì)算各個(gè)梗死灶面的長(zhǎng)度和寬度，確定梗死灶的最大面積。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS13.0軟件，行為學(xué)評(píng)價(jià)采用單因素方差分析(one-way ANOVA)LSD兩兩比較，梗死面積的統(tǒng)計(jì)用配對(duì)t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)

各組動(dòng)物在造模后及干細(xì)胞移植后均無死亡。

2.1.1 神經(jīng)功能評(píng)分:神經(jīng)功能評(píng)分在干細(xì)胞植入2周后顯著降低(P＜0.05)，這種差異一直持續(xù)到動(dòng)物全部被安樂(圖1)。

2.1.2 精準(zhǔn)上肢運(yùn)動(dòng)測(cè)試:干細(xì)胞治療后1 d，動(dòng)物的行為學(xué)表現(xiàn)已出現(xiàn)好轉(zhuǎn)，但與對(duì)照組比較無顯著性差異。從治療后3 d開始到治療后第8周，劑量組動(dòng)物抓取水果塊的時(shí)間顯著減少 (P＜0.05)(圖2)。

圖2 干細(xì)胞移植前后PET，MRI檢查結(jié)果Fig 2 The PET and MRI result before and after hBMSC transplantation of the high-dose group，the low-dose group，and the control group

2.2 MRI掃描

術(shù)后24 h手術(shù)區(qū)域可見DW1高信號(hào)，主要累及殼核外側(cè)和右側(cè)大腦半球顳頂葉皮質(zhì)，中線向左側(cè)移位，左側(cè)側(cè)腦室明顯受壓變形。移植后2周，高劑量組缺血損傷部位的修復(fù)速度高于低劑量組和對(duì)照組，移植后4、6、8和10周高、低劑量組缺血灶的修復(fù)速度基本相等，均高于對(duì)照組(圖2A－E)。

2.3 PET掃描

造模后缺血灶周圍的細(xì)胞代謝顯著降低。干細(xì)胞移植后2周缺血灶周圍皮質(zhì)的SUV逐漸升高(圖2F－U)。移植后4、6周高、低劑量組和對(duì)照組皮質(zhì)及殼核外側(cè)的SUV%顯著升高(P＜0.05)。8周時(shí)高劑量組皮質(zhì)的SUV%顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。其余時(shí)間點(diǎn)各組ROI的SUV%無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表1)。

2.4 組織病理學(xué)

2.4.1 梗死面積:干細(xì)胞移植后2、12周，低劑量組的梗死面積明顯小于對(duì)照組間(P＜0.05)(表2)。2.4.2 鏡下觀察結(jié)果:1)注射后2周模型組與高低劑量鏡下均可見腦膜增厚，腦膜血管擴(kuò)張充血，腦皮質(zhì)灶性壞死，泡沫細(xì)胞增生，胞漿內(nèi)含鐵血黃素沉積，灶性炎細(xì)胞浸潤(rùn)。壞死區(qū)周圍血管旁炎細(xì)胞袖套狀浸潤(rùn)。高、低劑量組腦組織空泡變性程度較模型組輕，可見較多新生血管。2)注射后12周模型組、高、低劑量組均可見腦皮質(zhì)局部缺損及瘢痕形成，泡沫細(xì)胞增生，周圍腦組織空泡變性(圖3)。

表1 移植前后感興趣區(qū)域SUV%值Table 1 SUV%in selected ROIs

表1 (續(xù))

表2 腦梗死面積Table 2 Iesion volume of brain

圖3 干細(xì)胞移植前后病理學(xué)檢查結(jié)果Fig 3 The pathological result before and after hBMSC transplantation of the high-dose group，the low-dose group，and the control group

3 討論

盡管很多學(xué)者已經(jīng)在小鼠、大鼠等動(dòng)物身上證明非人類BMSCs直接腦內(nèi)注射安全有效，并能在腦內(nèi)廣泛遷移和向神經(jīng)細(xì)胞方向分化［8－9］。但有關(guān)hBMSCs直接注入非人靈長(zhǎng)類腦內(nèi)效果的報(bào)導(dǎo)還很少。由于缺血性腦卒中發(fā)生的類型、病變的部位以及范圍各不相同，使干細(xì)胞移植選擇病例變得困難。有實(shí)驗(yàn)選擇局部缺血損害病例，相對(duì)于彌漫性腦缺血損害，可能更容易獲得良性分析結(jié)果［10］。并且目前尚無研究資料證實(shí)，干細(xì)胞移植治療對(duì)于腦白質(zhì)損害和皮質(zhì)損害療效有何不同。另外，關(guān)于BMSCs參與腦損傷修復(fù)的報(bào)道多集中于急性期［11－12］，分析其可能的原因是急性期的微環(huán)境有利于BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞的分化。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇使用光化學(xué)法建立穩(wěn)定的局灶性腦缺血模型，并在此基礎(chǔ)上用腦立體定位法在損傷局部周圍直接注入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并觀察到治療12周，通過行為學(xué)、影響學(xué)和組織病理學(xué)對(duì)移植效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)。組織病理學(xué)觀察到了梗死灶的明顯減小，移植組較對(duì)照組梗死灶周圍新生血管增生明顯。移植后2周MRI檢查可見模型組梗死灶修復(fù)速度慢于高劑量組。PET結(jié)果顯示第4、6和8周高劑量組的代謝增高速度明顯大于對(duì)照組。行為學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)對(duì)照組動(dòng)物術(shù)后肌肉麻痹，不能站立，上肢的精準(zhǔn)運(yùn)動(dòng)能力喪失，hBMSCs移植的動(dòng)物到12周時(shí)感覺和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能的缺失基本恢復(fù)。

本研究從影像學(xué)、行為學(xué)、組織病理學(xué)等方面證實(shí)hBMSCs移植到成年食蟹猴腦內(nèi)后動(dòng)物的神經(jīng)功能出現(xiàn)了改善。為進(jìn)一步研究干細(xì)胞這一治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病新手段的臨床應(yīng)用提供了參考，移植模式和評(píng)價(jià)方法對(duì)臨床有一定的指導(dǎo)義。

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