葛根芩連湯配伍對(duì)黃連生物堿腸吸收特性的影響

王 躍， 安 叡， 張藝竹， 肖 娟， 陳 燁， 王新宏

(上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203)

葛根芩連湯出自《傷寒論·太陽(yáng)病上篇》，有清泄里熱、解肌散邪之功效，由葛根、黃芩、黃連、甘草四味藥組成，有效成分包括黃酮、生物堿類等［1］。葛根芩連湯為口服給藥，其有效成分必先經(jīng)過(guò)腸道的吸收才能進(jìn)入體內(nèi)發(fā)揮藥效。

P-糖蛋白 (p-glycoprotein，P-gp)是一種由MDR1基因編碼的ATP依賴性膜轉(zhuǎn)運(yùn)體，其在消化道上的表達(dá)極其廣泛［2］，近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)腸道P-gp蛋白是影響藥物吸收及生物利用度的一個(gè)關(guān)鍵因素［3］，也是目前研究最多的腸道外排蛋白。葛根芩連湯中的有效成分小檗堿及其衍生物是P-gp的底物［4-5］，其口服生物利用度低的原因是P-gp的外排作用［6-7］。

本課題組的前期藥代動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葛根芩連湯中君藥葛根能促進(jìn)黃連中生物堿成分的吸收。故本研究采用目前常用于研究藥物吸收機(jī)制的模型——大鼠腸外翻生物模型，從腸道轉(zhuǎn)運(yùn)體P-gp的角度研究葛根芩連湯中黃連有效成分在不同配伍環(huán)境中的吸收動(dòng)力學(xué)變化，希冀為探索葛根芩連湯的配伍機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 Waters AcquityTM H-Class超高效液相色譜儀 (PDA Detecter，Sample Manager-FTN，Quaternary Solvent Manager)，Empower2色譜工作站。

1.2 動(dòng)物 SD大鼠，雄性，體質(zhì)量 (200±20)g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):SCXK(滬)2008-0016。

1.3 藥品及試劑 葛根Puerariae lobatae Radix、黃芩Scutellariae Radix、黃連Coptidis Rhizoma購(gòu)于上?？禈蛑兴庯嬈邢薰?，炙甘草Glycyrrhizae Radix et Rhizoma praeparata cum melle購(gòu)于上海金橋養(yǎng)和堂藥店;上述藥材經(jīng)陳燕軍藥師鑒定，符合2010版《中國(guó)藥典》一部規(guī)定。鹽酸黃連堿(coptisine，批號(hào):201011)購(gòu)于上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司;鹽酸藥根堿 (jatrorrhizine，批號(hào):110733-201007)、鹽酸小檗堿 (berberine，批號(hào):110713-200911)、鹽酸巴馬汀 (palmatine，批號(hào):110732-200907)、鹽酸維拉帕米 (verapamil，批號(hào):100223-200102)均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所 (現(xiàn)為中國(guó)食品藥品檢定研究院)。甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 Tyrode緩沖液的配置 分別稱取NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，CaCl20.2 g，NaHCO31.0 g，NaH2PO40.05 g，MgCl20.1 g，葡萄糖 1.0 g，超純水定容到1 L，調(diào)節(jié)至pH 7.2～7.4。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配置 精密稱取鹽酸黃連堿、鹽酸藥根堿、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀對(duì)照品適量，用甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為21.55、23.30、22.25、20.55 μg/mL的混合對(duì)照品貯備液 (以黃連堿、藥根堿、小檗堿、巴馬汀計(jì))。取鹽酸維拉帕米適量，精密稱定，用超純水定容至10 mL，得3.96 mg/mL貯備液備用 (以維拉帕米計(jì))。

2.3 腸外翻溶液的配置 葛根芩連湯全方由葛根15 g、黃芩9 g、黃連9 g、炙甘草6 g組成，按照全方各藥的比例確定各組藥物之間的比例稱取適量黃連、黃連-葛根 (黃連葛根質(zhì)量比為3∶5)、黃連-黃芩 (黃連黃芩質(zhì)量比為1∶1)、黃連-甘草(黃連甘草質(zhì)量比為3∶2)，分別加8倍量水，煎煮30 min，過(guò)濾;再加8倍量水，煎煮30 min，過(guò)濾，合并兩次濾液，濃縮定容。取各提取液，用Tyrode緩沖液稀釋成黃連提取液、含100 μmol/L維拉帕米的黃連提取液、黃連-葛根提取液、黃連-黃芩提取液、黃連-甘草提取液，各組黃連生藥質(zhì)量濃度均為5 mg/mL，冷藏備用。

2.4 動(dòng)物手術(shù) SD大鼠，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水。腹腔注射20%烏拉坦 (0.4 mL/100 g)麻醉，腹主動(dòng)脈取血后，將大鼠腸管同腸系膜剝離，分別取十二指腸 (從幽門以下約10 cm)、空腸(十二指腸回腸中間腸段)、回腸 (從盲腸向上大約10 cm)、結(jié)腸 (盲腸向下)各7 cm，放入4℃Tyrode液中，將內(nèi)容物沖洗干凈，然后小心剝離腸段表面的腸系膜和脂肪，將腸管翻轉(zhuǎn)，用Tyrode液沖洗后，腸管一端結(jié)扎塑料套管，另一端結(jié)扎，使之形成囊狀腸管。注入1 mL空白Tyrode液到腸囊內(nèi)，放入已有Tyrode液的麥?zhǔn)显〔壑?，?shí)驗(yàn)過(guò)程中保持37℃恒溫循環(huán)水，并向浴槽中通入95%O2/5%CO2，平衡5 min。

2.5 腸外翻實(shí)驗(yàn) 將平衡好的麥?zhǔn)显〔壑械腡yrode液倒出，分別給予配置好的腸外翻溶液，分別在給藥15，30，45，60，90，120 min從腸囊內(nèi)取樣200 μL，同時(shí)補(bǔ)足相同體積的空白Tyrode液。

2.6 樣品處理 取腸外翻實(shí)驗(yàn)樣品200 μL，定量加入甲醇400 μL，渦旋混勻，14 000×g離心5 min，取上清液過(guò)微孔濾膜進(jìn)樣分析。

2.7 腸外翻樣品中生物堿類成分的測(cè)定 ①色譜條件:Agilent Poroshell 120EC-C18色譜柱 (4.6 mm×50 mm，2.7-Micron);流動(dòng)相0.2%乙酸水溶液 (A)-甲醇 (B)，梯度洗脫 (0～10 min，25% ～35%，B);體積流量1 mL/min;柱溫25℃;檢測(cè)波長(zhǎng)345 nm;進(jìn)樣量5 μL。②標(biāo)準(zhǔn)曲線制備:精密吸取混合對(duì)照品貯備液10.00、5.00、2.50、1.00、0.50 mL，分別置于50mL量瓶中，用空白Tyrode溶液稀釋至刻度，搖勻，取上述不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，以各成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸計(jì)算。③精密度實(shí)驗(yàn):取已知質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，在確定色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，考察日內(nèi)和日間精密度。④專屬性實(shí)驗(yàn):在確定的色譜條件下，將混合對(duì)照品溶液和含藥的Tyrode液分別進(jìn)樣檢測(cè)，考察方法的專屬性。⑤穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn):取腸外翻供試品，置于37℃水浴中，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣檢測(cè)，考察樣品穩(wěn)定性。⑥加樣回收率實(shí)驗(yàn):取已知量的供試品9份，分別精密加入對(duì)照品溶液適量，按樣品處理方法制備溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，計(jì)算平均加樣回收率。

3 數(shù)據(jù)分析

藥物累計(jì)吸收量按以下公式計(jì)算:

Q累計(jì)為藥物各時(shí)間的累積吸收量，Cn為n時(shí)間點(diǎn)的實(shí)際檢測(cè)濃度。

對(duì)藥物的累積吸收量對(duì)時(shí)間作相關(guān)回歸分析，得出的斜率 (L)除以吸收表面積 (A)求得吸收速率常數(shù) (Ka，μg·min－1·cm－2)，公式如下。

4 結(jié)果

4.1 藥物濃度的測(cè)定 比較Tyrode液、混合對(duì)照品溶液、供試品溶液的色譜行為，結(jié)果表明在確定色譜條件下，各組分色譜峰處Tyrode液中物質(zhì)和樣品中其他成分對(duì)待測(cè)組分沒(méi)有干擾，且各組分的峰形較好，能夠完全分離 (圖1)。求得標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)表1，結(jié)果可見(jiàn)黃連各生物堿成分在考察質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好。本方法測(cè)定的各成分日間和日內(nèi)精密度RSD均小于1%。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)RSD小于2%。加樣回收率在98.3% ～100.4%之間，RSD小于2%(n=5)。

4.2 P-gp抑制劑對(duì)生物堿吸收的影響 取含有和不含維拉帕米的黃連提取液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察P-gp對(duì)生物堿的影響。結(jié)果顯示 (表2)，在各腸段，各生物堿的Ka值均有顯著性提高 (P＜0.05)，說(shuō)明藥根堿、黃連堿、小檗堿、巴馬汀均為P-gp的底物。

圖1 空白tyrode液 (A)、標(biāo)準(zhǔn)品溶液 (B)和樣品 (C)的UPLC色譜圖Fig.1 UPLC chromatograms of blank tyrode(A)，blank tyrode spiked with standard compounds(B)and samples(C)

表1 線性關(guān)系結(jié)果Tab.1 Result of linearity correlations

4.3 各配伍組對(duì)生物堿吸收的影響 各配伍組吸收常數(shù)Ka值如表3所示。配伍葛根后，在十二指腸、空腸段各生物堿比黃連組均有明顯的提高，其中小檗堿和巴馬汀的P＜0.01，同時(shí)在回腸段藥根堿的吸收也有增加。在黃芩的作用下，在回腸和結(jié)腸段黃連堿、小檗堿和巴馬汀均有顯著提高，其中在回腸段小檗堿和巴馬汀、結(jié)腸段巴馬汀的P＜0.01;在十二指腸段藥根堿和巴馬汀、空腸段巴馬汀的吸收也有提高。在甘草的作用下，僅僅在十二指腸段巴馬汀、回腸段藥根堿的吸收有所提高(以上P＜0.05)。

表2 維拉帕米對(duì)4種生物堿的腸吸收參數(shù)Ka值的影響［μg/(min·cm2)，n=5，±s］Tab.2 Effect of verapamil on Kaof coptisine，jatrorrhizine，berberine and palmatine［μg/(min·cm2)，n=5，±s］

表2 維拉帕米對(duì)4種生物堿的腸吸收參數(shù)Ka值的影響［μg/(min·cm2)，n=5，±s］Tab.2 Effect of verapamil on Kaof coptisine，jatrorrhizine，berberine and palmatine［μg/(min·cm2)，n=5，±s］

注:與黃連組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

腸段 組別 黃連堿 藥根堿 小檗堿 巴馬汀十二指腸 黃連組 0.993±0.033 0.307±0.009 0.975±0.100 0.430±0.021黃連維拉帕米組 3.017±0.172＊＊ 1.320±0.065＊＊ 4.160±0.253＊＊ 1.480±0.054＊＊空腸 黃連組 1.567±0.074 0.623±0.052 1.854±0.222 0.867±0.024黃連維拉帕米組 2.427±0.108* 1.110±0.064* 2.942±0.322＊＊ 1.200±0.070*回腸 黃連組 0.997±0.012 0.243±0.025 0.752±0.107 0.453±0.021黃連維拉帕米組 2.883±0.155＊＊ 1.227±0.070＊＊ 3.552±0.465＊＊ 1.367±0.069＊＊結(jié)腸 黃連組 1.113±0.050 0.553±0.037 1.244±0.042 0.677±0.012黃連維拉帕米組 2.547±0.144＊＊ 0.970±0.051* 2.680±0.362＊＊ 1.050±0.036＊＊

5 討論

腸外翻模型操作簡(jiǎn)單、快捷、廉價(jià)，技術(shù)要求低，保持相對(duì)完整的組織和黏膜特性，給出的數(shù)據(jù)可靠且與體內(nèi)吸收情況比較相似，腸外翻模型是用來(lái)研究藥物吸收機(jī)制最為常用的模型之一［8］。

在維拉帕米的作用下，黃連提取物中的黃連堿、藥根堿、小檗堿、巴馬汀在各個(gè)腸段的吸收有了明顯提高，說(shuō)明黃連堿、藥根堿、小檗堿、巴馬汀是P-gp的底物，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致［9］。

如表2所示，在十二指腸、空腸，葛根提取物也起到類似P-gp抑制劑的作用，使得各生物堿的吸收有了大幅度的提高，這與本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合［10］;在回腸和結(jié)腸，黃芩提取物使得黃連堿、小檗堿、巴馬汀的吸收有了明顯提高，但提高的程度沒(méi)有葛根明顯，這確定了葛根的君藥地位。另有文獻(xiàn)報(bào)道黃芩苷是多耐藥相關(guān)蛋白2(Mrp2)的底物［11］，也可以起到競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用;由于腸道上除了有P-gp外排蛋白，還有Mrp2外排蛋白、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)攝取蛋白、溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)攝取蛋白等，出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是各種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白一起共同作用的結(jié)果，現(xiàn)在對(duì)它們的研究比較少，有待進(jìn)一步進(jìn)行研究。甘草在各腸段對(duì)黃連成分吸收促進(jìn)均無(wú)明顯作用，甚至有減弱的趨勢(shì)。葛根為方中的君藥，起到最主要的作用，能大幅提高黃連中的有效成分小檗堿及其衍生物的吸收;黃芩為臣藥，輔佐君藥，進(jìn)一步增加小檗堿及其衍生物的吸收;甘草為使藥，起到調(diào)和諸藥的作用，使其保持在安全的質(zhì)量濃度范圍。小檗堿及其衍生物是有效成分，具有廣譜的抗菌作用，能用來(lái)治療糖尿病，高血脂等［12-13］，同時(shí)也是毒性成分［14］，所以保證其在體內(nèi)的濃度在安全的范圍內(nèi)顯得尤為重要。根據(jù)中醫(yī)理論，方中以葛根為主藥，具有解肌透表的作用，黃芩、黃連苦寒，清除里熱，甘草和中安正，解熱毒。諸藥合用共奏解表清里之功，臨床常用用于消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)疾病，對(duì)糖尿病也有很好的效果［15］。各藥協(xié)同作用，使方中的有效成分生物堿保持在合適的范圍內(nèi)，發(fā)揮抗菌、降膽固醇及改善葡萄糖耐量的藥理活性作用，輔助全方發(fā)揮治療作用。通過(guò)觀察不同配伍組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，初步嘗試從藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的角度來(lái)解釋復(fù)方配伍的合理性。

表3 4種生物堿在各配伍組各腸段中的Ka值［μg/(min·cm2)，n=5，±s］Tab.3 Kaof coptisine，jatrorrhizine，berberine and palmatine in different groups［μg/(min·cm2)，n=5，±s］

表3 4種生物堿在各配伍組各腸段中的Ka值［μg/(min·cm2)，n=5，±s］Tab.3 Kaof coptisine，jatrorrhizine，berberine and palmatine in different groups［μg/(min·cm2)，n=5，±s］

注:與黃連組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

腸 段 組 別 黃連堿 藥根堿 小檗堿 巴馬汀十二指腸 黃連組 0.993±0.033 0.307±0.009 0.975±0.100 0.430±0.021黃連葛根組 1.453±0.058* 0.573±0.041* 1.644±0.196＊＊ 1.320±0.057＊＊黃連黃芩組 1.047±0.017 0.527±0.012* 1.088±0.134 0.737±0.005*黃連甘草組 1.297±0.033 0.367±0.019 1.172±0.119 0.953±0.042*空腸 黃連組 1.567±0.074 0.623±0.052 1.854±0.222 0.867±0.024黃連葛根組 2.480±0.123* 0.730±0.033* 2.888±0.399＊＊ 2.480±0.062＊＊黃連黃芩組 1.537±0.066 0.603±0.026 1.406±0.174 1.283±0.066*黃連甘草組 1.053±0.033 0.523±0.037 1.062±0.136 0.770±0.014回腸 黃連組 0.997±0.012 0.243±0.025 0.752±0.107 0.453±0.021黃連葛根組 1.043±0.054 0.473±0.034* 0.926±0.148 0.463±0.012黃連黃芩組 1.320±0.024* 0.293±0.012 1.500±0.175＊＊ 1.440±0.033＊＊黃連甘草組 1.087±0.017 0.405±0.039* 0.972±0.184 0.687±0.021結(jié)腸 黃連組 1.113±0.050 0.553±0.037 1.244±0.042 0.677±0.012黃連葛根組 0.913±0.029 0.587±0.021 1.104±0.119 0.890±0.094黃連黃芩組 1.563±0.085* 0.540±0.029 1.534±0.184* 1.063±0.025＊＊黃連甘草組 1.327±0.066 0.353±0.025 0.908±0.060 0.563±0.021

腸外翻模型得到的數(shù)據(jù)與體內(nèi)吸收最為相似，保持了比較完整的組織和黏膜特性，但是具有同體內(nèi)一樣的復(fù)雜情況，導(dǎo)致數(shù)據(jù)的解讀難度大。

Caco-2細(xì)胞來(lái)源于人的直腸癌細(xì)胞，結(jié)構(gòu)和功能類似于人小腸上皮細(xì)胞，并含有與小腸刷狀緣上皮相關(guān)的酶系，細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)研究表明，Caco-2細(xì)胞與人小腸上皮細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上相似，具有相同的細(xì)胞極性和緊密連接。且Caco-2細(xì)胞能特異性的過(guò)量表達(dá)P-gp外排蛋白，因此，本課題組將采用Caco-2細(xì)胞模型進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

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