鋅影響坐骨神經(jīng)損傷模型小鼠脊髓P物質(zhì)表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究

張 莉，劉 明，王月靜

遼寧醫(yī)學(xué)院 組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，遼寧錦州 121001

神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain，NPP)是繼發(fā)于中樞或者外周神經(jīng)系統(tǒng)損傷之后的慢性疾病狀態(tài)，原因包括感染、外傷、腫瘤等，主要表現(xiàn)是痛覺過敏、痛覺超敏、感覺缺失及自發(fā)疼痛等，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，外周神經(jīng)損傷后，脊髓P物質(zhì)(substance P，SP)表達(dá)增高，從而加重NPP的癥狀[3]；而微量元素鋅能提高NPP動物的痛閾，減輕痛覺過敏現(xiàn)象，因此，為深入研究鋅對NPP的影響，我們應(yīng)用坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷(sciatic nerve injure，SNI)手術(shù)制備NPP動物模型，利用原子吸收光譜技術(shù)、免疫組織化學(xué)技術(shù)、免疫印跡技術(shù)和圖像分析技術(shù)研究鋅對NPP模型動物脊髓P物質(zhì)(substance P，SP)的影響，從而為研究鋅參與NPP的可能機(jī)制提供基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1 動物分組與模型制備 48只CD1小鼠隨機(jī)分為4組：1)對照組(Con)：正常動物接受假手術(shù)；2)適鋅喂養(yǎng)神經(jīng)分支損傷(N-NPP)：適鋅飼料[鋅：30.0 mg/(kg·d)]喂養(yǎng)2周后接受SNI手術(shù)；3)低鋅喂養(yǎng)神經(jīng)分支損傷(L-NPP) ：低鋅喂養(yǎng)[鋅：0.85 mg/(kg·d)]2周后接受SNI；4)高鋅喂養(yǎng)神經(jīng)分支損傷(H-NPP)：高鋅喂養(yǎng)[飲用硫酸鋅水溶液，227 mg/(L·d)]2周后接受SNI手術(shù)。SNI手術(shù)：暴露坐骨神經(jīng)主干至坐骨神經(jīng)分叉，保留腓腸神經(jīng)，結(jié)扎并切斷腓總神經(jīng)和脛神經(jīng)后逐層縫合。假手術(shù)：只暴露和分離坐骨神經(jīng)主干至坐骨神經(jīng)分叉處，之后逐層縫合。

2 主要試劑與儀器 山羊抗小鼠多克隆SP抗體和兔抗山羊IgG多克隆抗體購自Santa公司；免疫組織化學(xué)染色試劑盒和DAB染色劑均購自福州邁新公司；GAPDH鼠單克隆抗體購自康成生物公司；ECL試劑盒和膠片購自Santa公司；PVDF膜和蛋白marker購自NEB公司；光學(xué)顯微鏡、原子吸收光譜儀和計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)等。

3 取材與標(biāo)本制備 于SNI術(shù)后7d，將各組小鼠經(jīng)4%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔麻醉，取小鼠血清和腰5節(jié)段脊髓，一部分放置于-20 ℃凍存，用于原子吸收光譜技術(shù)檢測和免疫印跡檢測；一部分經(jīng)4%多聚甲醛固定12 h，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，制備5 μm厚的石蠟切片，用于免疫組織化學(xué)染色。

4 原子吸收光譜技術(shù)檢測血清和脊髓鋅的含量于SNI術(shù)后7 d取血清和脊髓組織。取血清0.5 ml，加入三氯醋酸，3 000 r/min離心5 min，取上清液，加入SDS-Tris緩沖劑、顯色劑和水合氯醛溶液，于波長555 nm處比色，計(jì)算血清鋅含量。脊髓組織經(jīng)混合酸浸泡過夜后消化，用1%硝酸溶解備用。利用原子吸收光譜分析法測定脊髓中的鋅含量。

5 免疫組織化學(xué)染色檢測SP在脊髓的表達(dá) 石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，微波修復(fù)。3% H2O2孵育10 min；PBS沖洗，5 min×3次；正常非免疫動物血清孵育10 min；山羊抗小鼠多克隆SP抗體(1∶100)，4 ℃孵育過夜；PBS沖洗，5 min×3次；兔抗山羊IgG(1∶200)室溫下孵育10 min；PBS沖洗，5 min×3次；鏈霉素抗生物素-過氧化物酶孵育10 min；PBS沖洗，5 min×3次；DAB顯色5 min，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，常規(guī)脫水、透明和封片，光鏡下觀察。用正常非免疫動物血清代替一抗作為陰性對照。

6 免疫印跡技術(shù)檢測SP在脊髓的表達(dá) 脊髓組織稱重后剪碎，加入裂解液，進(jìn)行超聲波粉碎，4 ℃過夜，低溫離心取上清液。測蛋白濃度，沸水浴煮5 min，離心備用。制備分離膠，加樣，SDSPAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，染膜，封閉，加一抗：山羊抗小鼠多克隆SP抗體(1∶500) 4 ℃孵育過夜，TBST漂洗，5 min×3次，加二抗(兔抗山羊IgG，1∶5 000)孵育2 h。TBST漂洗，5 min×3次，ECL發(fā)光，X線曝光、顯影、定影，計(jì)算機(jī)圖像分析。

7 圖像分析SP在脊髓的表達(dá) 用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)對免疫組化和免疫印跡結(jié)果進(jìn)行圖像分析。每個樣本選取5張切片，每張切片于400倍光鏡下系統(tǒng)隨機(jī)選取3個視野進(jìn)行檢測，計(jì)算平均光密度值(average optical，AO)。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用-x±s表示，采用單因素方差分析(ANOVA)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組鋅含量比較 對照組(Con)血清鋅(23.42±0.67) μmol/L，脊髓鋅(7.16±0.11) mg/kg；SNI術(shù)后7 d，適鋅飼料喂養(yǎng)的NPP小鼠血清鋅(15.14±0.58) μmol/L，脊髓鋅(5.23±0.21) mg/kg；高鋅喂養(yǎng)(H-NPP)組血清鋅(30.12±0.52) μmol/L，脊髓鋅(10.27±0.16) mg/kg；低鋅喂養(yǎng)(L-NPP)組血清鋅(10.87±0.43) μmol/L，脊髓鋅(3.01±0.19) mg/kg；各組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，高鋅組能提高鋅含量，低鋅組加重缺鋅狀態(tài)，見圖1、2。

圖 1 各組小鼠血清鋅的含量(μmol/L， n=6)aP＜0.01， 各組間比較Fig. 1 Serum zinc level in different groups(μmol/L, n=6)aP＜0.01， vs each group

圖 2 各組小鼠脊髓鋅的含量(mg/kg， n=6)aP＜0.01， 各組間比較Fig. 2 Serum zinc level in spinal cord of different groups(mg/kg, n=6)aP＜0.01， vs each group

2 SP陽性率比較 SP陽性反應(yīng)產(chǎn)物呈棕褐色顆粒狀，主要表達(dá)在脊髓后角的灰質(zhì)淺層。與對照組相比，其他三組NPP動物脊髓后角的SP陽性顆粒均顯著增多，平均光密度(AO)值均增高(P<0.01)。其中，L-NPP組的SP陽性顆粒最密集，AO值最高；H-NPP組的陽性顆粒最少，AO值最低(P<0.01)，見圖3、4。

圖 3 SP在各組模型動物脊髓的表達(dá)(免疫組化，×200) A： 低鋅喂養(yǎng)組； B： 高鋅喂養(yǎng)組; C： 正常喂養(yǎng)的NPP組; D： 對照組模型動物Fig. 3 Expression of substance P in L-NPP group (A), H-NPP group (B), N-NPP group (C) and control group (D)(immunohistochemistry, ×200)

圖 6 各組小鼠脊髓SP表達(dá)的免疫印跡圖像分析結(jié)果(n=6)aP＜0.01， 各組間比較Fig. 6 Immune blotting showing expression of substance P in spinal cord of different groups(n=6)aP＜0.01, vs each group

3 各組SP蛋白免疫印跡比較 圖像分析顯示：與對照組相比，其他三組NPP動物脊髓中的SP蛋白表達(dá)均顯著增高(P<0.01)。其中，L-NPP組SP蛋白的表達(dá)最高，而H-NPP組SP蛋白的表達(dá)最低(P<0.01)，見圖5、6。

討 論

實(shí)驗(yàn)表明，鋅離子可能與NPP的產(chǎn)生與傳導(dǎo)存在著十分密切的關(guān)系。Velázquez等[4]和Zhang等[5]發(fā)現(xiàn)，在脊髓和背根神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元中在豐富的金屬硫蛋白-Ⅲ和游離鋅離子，而且，在脊髓后角和背根神經(jīng)節(jié)中分布有大量的含鋅初級傳入神經(jīng)元。Wenzel等[6]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)神經(jīng)沖動傳導(dǎo)到含鋅神經(jīng)元的軸突終末時，儲存在軸突終末突觸小泡中的鋅離子能夠與神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)調(diào)質(zhì)一同釋放，從而影響突觸后神經(jīng)元的興奮或抑制。Jo等[7]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠在進(jìn)行脊神經(jīng)背根切斷手術(shù)后，機(jī)械痛閾顯著降低，出現(xiàn)痛覺過敏現(xiàn)象；而且，在脊髓背角灰質(zhì)淺層當(dāng)中的鋅離子顯著減少。本研究中也發(fā)現(xiàn)，坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷后，小鼠血清和脊髓中的鋅離子含量顯著減少，分析出現(xiàn)這種情況的原因可能有三個：第一，坐骨神經(jīng)分支切斷后，從神經(jīng)末梢攝入到背根神經(jīng)節(jié)中的鋅顯著減少，造成其在脊髓后角的釋放減少；第二，神經(jīng)損傷時，由于伴隨神經(jīng)遞質(zhì)在脊髓的大量快速耗竭，造成脊髓中的鋅減少；第三，外周神經(jīng)損傷時，大量炎性物質(zhì)的釋放導(dǎo)致腎臟排泄鋅加快，鋅從血清中轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟等器官儲存起來，因此造成血清鋅減少；而NPP時鋅離子含量的減少也提示著鋅可能與NPP存在著某種密切的關(guān)系。

研究發(fā)現(xiàn)，脊髓后角P物質(zhì)(substance P，SP)表達(dá)上調(diào)是NPP的重要機(jī)制[8-10]，SP在脊髓的表達(dá)變化也被作為研究NPP發(fā)病機(jī)制的觀察指標(biāo)之一。在脊髓內(nèi)，SP主要分布于后角的灰質(zhì)淺層，尤其是在一些直徑較細(xì)的傷害性初級傳入神經(jīng)纖維的末梢部位，當(dāng)它被釋放就能與突觸后神經(jīng)元的神經(jīng)激肽受體1結(jié)合，從而在痛覺的產(chǎn)生與傳遞中發(fā)揮重要的作用[11-13]。研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠的后爪足底進(jìn)行手術(shù)切口能使動物脊髓后角SP表達(dá)增多[14]；鞘內(nèi)應(yīng)用SP后，動物的熱痛閾顯著降低，出現(xiàn)熱痛覺過敏現(xiàn)象，提示SP能參與傷害性信息在脊髓中的產(chǎn)生與傳遞，從而產(chǎn)生致痛作用[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷時，小鼠脊髓后角淺層的SP表達(dá)增多，提示SP在脊髓后角的高表達(dá)參與了NPP的產(chǎn)生與傳導(dǎo)過程。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，高鋅喂養(yǎng)能使血清和脊髓中的鋅含量增高，SP表達(dá)降低；低鋅喂養(yǎng)可致SP表達(dá)增高，提示鋅可能抑制了SP在NPP模型動物脊髓中的表達(dá)。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷時，低鋅喂養(yǎng)可以使血清和脊髓中的鋅離子濃度更低，SP表達(dá)更高；而高鋅喂養(yǎng)能使血清和脊髓中的鋅離子濃度增加，SP表達(dá)降低；提示鋅可能抑制了脊髓后角SP的表達(dá)。但是，鋅離子在NPP中的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

1 Hussain AM， Khan MA. Pain management after traumatic spinal cord injury［J］. J Coll Physicians Surg Pak， 2012， 22（4）： 246-247.

2 Fornasari D. Pain mechanisms in patients with chronic pain［J］.Clin Drug Investig， 2012， 32（Suppl 1）：45-52.

3 Bring DK， Paulson K， Renstrom P， et al. Residual substance P levels after capsaicin treatment correlate with tendon repair［J］. Wound Repair Regen， 2012， 20（1）： 50-60.

4 Velázquez RA， Cai Y， Shi Q， et al. The distribution of Zinc selenite and expression of metallothionein-III mRNA in the spinal cord and dorsal root ganglia of the rat suggest a role for Zinc in sensory transmission［J］. J Neurosci， 1999， 19（6）： 2288-2300.

5 Zhang L， Chi ZH， Ren H， et al. Imunoreactivity of Zinc transporter 7（ZNT7） in mouse dorsal root ganglia［J］. Brain Res Bull， 2007， 74（4）： 278-283.

6 Wenzel HJ， Cole TB， Born DE， et al. Ultrastructural localization of zinc transporter-3 （ZnT-3） to synaptic vesicle membranes within mossy fiber boutons in the hippocampus of mouse and monkey［J］.Proc Natl Acad Sci U S A， 1997， 94（23）：12676-12681.

7 Jo SM， Danscher G， Schr?der HD， et al. Depletion of vesicular Zinc in dorsal Horn of spinal cord causes increased neuropathic pain in mice［J］. Biometals， 2008， 21（2）： 151-158.

8 Malmsj? M， Gustafsson L， Lindstedt S， et al. Negative pressure wound therapy-associated tissue trauma and pain： a controlled in vivo study comparing foam and gauze dressing removal by immunohistochemistry for substance P and calcitonin gene-related peptide in the wound edge［J］. Ostomy Wound Manage， 2011， 57（12）： 30-35.

9 Roche M， Kerr DM， Hunt SP， et al. Neurokinin-1 receptor deletion modulates behavioural and neurochemical alterations in an animal model of depression［J］. Behav Brain Res， 2012， 228（1）： 91-98.

10 Lin CC， Chen WN， Chen CJ， et al. An antinociceptive role for substance P in acid-induced chronic muscle pain［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 2012， 109（2）： E76-E83.

11 Brink TS， Pacharinsak C， Khasabov SG， et al. Differential modulation of neurons in the rostral ventromedial medulla by neurokinin-1 receptors［J］. J Neurophysiol， 2012， 107（4）：1210-1221.

12 Bie B， Zhao ZQ. Peripheral inflammation alters desensitization of substance P-evoked current in rat dorsal root ganglion neurons［J］.Eur J Pharmacol， 2011， 670（2-3）： 495-499.

13 Wang YJ， Li XF， Ding F， et al. Noradrenaline regulates substance P release from rat dorsal root ganglion neurons in vitro［J］. Neurosci Bull， 2011， 27（5）： 300-306.

14 胡興國，鐘敏，曾因明．鞘內(nèi)注射新斯的明對手術(shù)切口引起的大鼠脊髓背角P物質(zhì)表達(dá)的影響［J］.中國疼痛醫(yī)學(xué)雜志，2005，11（2）：96-99．

15 Wajima Z， Hua XY， Yaksh TL. Inhibition of spinal protein kinase C blocks substance P-mediated hyperalgesia［J］. Brain Res， 2000，877（2）： 314-321.