TNF-α對(duì)腎血管收縮敏感性的影響

郭蓮怡，王桂君，史 璇

遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 消化科，遼寧錦州 121001

肝腎綜合征(hepatorenal syndrome，HRS)是由于嚴(yán)重的肝功能損害及門(mén)脈高壓所致的急性功能性腎衰竭，是終末期肝病常見(jiàn)的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，腎血管收縮是HRS的主要原因。有研究表明肝硬化時(shí)腎臟對(duì)縮血管物質(zhì)的敏感性增強(qiáng)[1]。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)作為重癥肝炎發(fā)生的重要因子[2]，與重癥感染時(shí)腎衰的發(fā)生發(fā)展明顯相關(guān)[3]。然而，TNF-α在HRS腎血管收縮中的作用及機(jī)制目前還不清楚。本研究應(yīng)用離體灌注腎技術(shù)觀察TNF-α預(yù)灌流離體大鼠腎臟后，腎血管對(duì)內(nèi)皮素(endothelin，ET)收縮反應(yīng)性的改變。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇清潔級(jí)雄性SD大鼠28只，體質(zhì)量250~300 g。(由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(遼)2003-0007，開(kāi)放系統(tǒng)飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h)。

2 主要試劑和儀器 TNF-α(Sigma公司)、ET-1(Sigma公司)、2-氨基乙基二苯硼酸鹽(2-APB，Sigma公司)、無(wú)鈣Kreb's灌流液。Minipuls2灌注泵，法國(guó)Gilson；RM6000多導(dǎo)生理記錄儀，日本；恒溫灌注池，廣東；Oxnard CA張力換能器，美國(guó)Gould；氧合器，熱交換器、HTG恒溫器，上海；倒置顯微鏡，德國(guó)Carl Zeiss公司。

3 離體灌注腎實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕4]應(yīng)用戊巴比妥鈉(30 mg/kg)經(jīng)腹腔注射將大鼠麻醉。剪毛，腹壁消毒，正中切開(kāi)，用棉簽分離腸系膜上動(dòng)脈、右腎動(dòng)脈、右腎靜脈及右側(cè)輸尿管。用套管針從腸系膜上動(dòng)脈插管，經(jīng)腹主動(dòng)脈，插入右腎動(dòng)脈起始部，管外接三通，三通接張力換能器和灌注裝置，腎靜脈開(kāi)放。在腸系膜上動(dòng)脈及右腎動(dòng)脈主干分別結(jié)扎。整個(gè)手術(shù)過(guò)程均在10 min左右完成。左腎取出稱(chēng)重作為對(duì)照腎重。灌注過(guò)程：在腹主動(dòng)脈插管至腎動(dòng)脈時(shí)啟動(dòng)灌注泵，開(kāi)始灌流。灌注液流量恒定為5 ml/min，經(jīng)熱交換器加溫至37℃，經(jīng)氧合器持續(xù)給95%氧和5%二氧化碳的混合氣，灌流液為一次性，不再循環(huán)應(yīng)用。

4 實(shí)驗(yàn)分組 28只大鼠制備離體灌注腎模型后隨機(jī)分為4組(n=7)，平衡期后(開(kāi)始灌流5~10 min后，繼續(xù)穩(wěn)定20 min，共30 min)，進(jìn)入正式實(shí)驗(yàn)。具體分組：A1組(n=7)：平衡期后，無(wú)鈣Kreb's液灌流90 min，加ET(1 nmol/L)刺激；A2組(n=7)：平衡期后，用含TNF-α(100 μg/L)的無(wú)鈣Kreb's液灌流90 min，加ET(1 nmol/L)刺激；B1組(n=7)：平衡期后，用無(wú)鈣Kreb's液灌流90 min(其中后10 min加入30 μmol/L的2-APB)，加ET(1 nmol/L)刺激；B2組(n=7)：平衡期后，用含TNF-α(100 μg/L)的無(wú)鈣Kreb's液灌流90 min(其中后10 min加入30 μmol/L的2-APB)，加ET(1 nmol/L)刺激。

5 離體腎體外灌注過(guò)程 整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程由多導(dǎo)生理記錄儀連續(xù)記錄腎臟灌注壓。實(shí)驗(yàn)過(guò)程分三個(gè)階段：第一階段(平衡期)：4組在灌流通路上，均先用無(wú)鈣Kreb's液灌流30 min，以達(dá)到平衡；第二階段(灌流期)：各組分別用含特定成分的無(wú)鈣Kreb's液灌流90 min；第三階段(刺激期)：各組均予含ET(1 nmol/L)的無(wú)鈣Kreb's液繼續(xù)灌流20 min。據(jù)報(bào)道離體腎體外灌流140 min內(nèi)血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定[4]，故整個(gè)灌流過(guò)程持續(xù)時(shí)間為140 min。

6 腎臟水腫率及病理檢查 灌流結(jié)束后，各組腎標(biāo)本稱(chēng)重，計(jì)算腎臟水腫率，腎臟水腫率=(灌流后腎重-對(duì)照腎重)/對(duì)照腎重。4%的多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋、HE染色觀察腎小球及腎小管形態(tài)、結(jié)構(gòu)。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)量資料(即各組灌注壓值)以-x±s表示，各組數(shù)據(jù)比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 對(duì)基礎(chǔ)灌注壓的影響 平衡期過(guò)后，各組基礎(chǔ)灌注壓比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。TNF-α、2-APB預(yù)灌流時(shí)，基礎(chǔ)灌注壓無(wú)明顯改變。

2 TNF-α對(duì)ET縮血管作用的影響 A1、A2組在應(yīng)用ET(1 nmol/L)刺激后，腎灌注壓較基礎(chǔ)壓均明顯升高(P＜0.05)；A2組灌注壓升高值顯著高于A1組(P＜0.01)。見(jiàn)圖1，表1。

圖 1 TNF-α對(duì)ET縮血管作用的影響Fig. 1 Effect of TNF-α on renal vasoconstriction by ET

3 阻斷IP3R對(duì)TNF-α作用的影響 B1、B2組于灌流后期加入2-APB，刺激期用ET(1 nmol/L)刺激，腎灌注壓均略升高，但與基礎(chǔ)灌注壓比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)；兩組灌注壓升高值比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。見(jiàn)圖2，表1。

表1 各組大鼠離體腎灌注壓水平Tab. 1 Renal perfusion pressure of each group(mmHg, -x±s, n=7)

4 腎臟水腫率及病理變化 4組腎臟的水腫率分別為28%±2%、29%±3%、28%±3%、27%±2%，且灌流后的腎臟標(biāo)本切片經(jīng)HE染色均未發(fā)現(xiàn)明顯的器質(zhì)性損傷，與灌流前相符。見(jiàn)圖3。

討 論

重型肝炎和各種原因引起的肝硬化常并發(fā)多臟器功能衰竭，尤其當(dāng)并發(fā)HRS時(shí)，患者的預(yù)后極差，80%~100%的患者在診斷后的1個(gè)月內(nèi)死亡。HRS不同于原發(fā)性腎臟疾病的腎衰竭，它缺乏后者所具有的臨床、實(shí)驗(yàn)室和組織學(xué)的改變，目前認(rèn)為HRS的發(fā)生是由于腎血管收縮造成腎臟明顯低灌流的結(jié)果，其機(jī)制尚不完全清楚。當(dāng)HRS發(fā)生時(shí)，患者血清中許多縮血管活性物質(zhì)水平明顯增高，并可直接或通過(guò)間接途徑引起腎血管收縮，是導(dǎo)致腎血流灌注和腎功能紊亂的重要介質(zhì)[1]。近年來(lái)學(xué)者們認(rèn)為：重型肝炎患者血中高濃度的TNF-α是引起多臟器功能衰竭發(fā)生的重要因子[2]，許多研究表明TNF-α可通過(guò)多種途徑引起血管收縮，從而參與相關(guān)疾病的病理生理過(guò)程：1)TNF-α可通過(guò)TNFR2和ET-ETR依賴(lài)途徑引起血管收縮。TNF-α可通過(guò)引起ET產(chǎn)生增多來(lái)發(fā)揮縮血管作用。當(dāng)阻斷ETA、、ETB受體后，TNF-α就不再有縮血管作用了[5]。2)TNF-α抑制內(nèi)皮依賴(lài)的一氧化氮-環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷(NO-CGMP)途徑導(dǎo)致血管收縮。首先TNF-α通過(guò)活化蛋白激酶C(PKC)抑制內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)磷酸化從而抑制eNOS的活性；同時(shí)TNF-α可通過(guò)縮短eNOS mRNA的半衰期來(lái)下調(diào)eNOS mRNA[6]。3)TNF-α可增強(qiáng)Ca2+依賴(lài)及非Ca2+依賴(lài)蛋白激酶活性，增強(qiáng)血管平滑肌細(xì)胞收縮[7]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：腎臟經(jīng)含TNF-α的無(wú)鈣Kreb's液灌流后，其腎血管對(duì)ET的反應(yīng)提高，表現(xiàn)為腎血管灌注壓明顯高于非TNF-α處理組。結(jié)果顯示：TNF-α可增強(qiáng)ET引起的腎血管收縮。

腎血流量受血管平滑肌的收縮和舒張調(diào)節(jié)，而血管平滑肌的收縮和舒張又受平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+調(diào)節(jié)。細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加受兩個(gè)作用機(jī)制來(lái)調(diào)控[8]：一方面胞外Ca2+進(jìn)入胞內(nèi)：各種刺激，如膜電壓改變、受體結(jié)合、第二信使及機(jī)械刺激都可以使細(xì)胞膜上的Ca2+通道開(kāi)放，引起胞外Ca2+大量?jī)?nèi)流；另一方面胞內(nèi)鈣庫(kù)釋放Ca2+：各種刺激使肌漿網(wǎng)(內(nèi)質(zhì)網(wǎng))膜上的鈣釋放通道開(kāi)放，引起細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)備Ca2+的釋放。本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用無(wú)鈣Kreb's液灌流腎臟，不存在胞外Ca2+內(nèi)流這一因素，因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明：TNF-α可通過(guò)促進(jìn)胞內(nèi)鈣釋放進(jìn)而增強(qiáng)ET的腎血管收縮作用。

已知ET等血管活性物質(zhì)與靶細(xì)胞膜上特異性受體(如ET受體)結(jié)合后，使膜磷脂酰肌醇4，5-二磷酸發(fā)生磷酸化生成IP3，IP3與IP3R(胞內(nèi)主要的Ca2+釋放通道)結(jié)合則促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放，使胞內(nèi)Ca2+水平增高[9]，引起細(xì)胞收縮。2-APB是一種常用的IP3R的阻斷劑，可特異性阻斷IP3R[10]，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用含2-APB及TNF-α的無(wú)鈣Kreb's液灌流腎臟，其腎血管對(duì)ET的反應(yīng)較差，ET刺激后的腎血管灌注壓無(wú)顯著變化。結(jié)果表明：2-APB可阻斷TNF-α的前述作用，說(shuō)明TNF-α可能通過(guò)上調(diào)IP3R進(jìn)而增強(qiáng)ET引起的腎血管收縮。

已有研究報(bào)道：TNF-α可誘導(dǎo)腎小球纖維蛋白沉積、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞凋亡，引起GFR下降。因此實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，所有的腎臟標(biāo)本稱(chēng)重，計(jì)算其水腫率＜30%，說(shuō)明灌流成功；并進(jìn)行常規(guī)病理檢查均未發(fā)現(xiàn)腎小管及腎小球細(xì)胞病理性改變，故排除了實(shí)驗(yàn)結(jié)果受器質(zhì)性腎臟損傷影響的因素[11]。

綜上所述，重癥肝炎患者血中存在的高濃度TNF-α可能上調(diào)IP3R，促進(jìn)胞內(nèi)鈣釋放，誘導(dǎo)腎入球動(dòng)脈平滑肌收縮性增強(qiáng)，腎入球動(dòng)脈收縮，造成腎血流減少，參與HRS發(fā)生。

1 Leung W， Wong F. Hepatorenal syndrome： do the vasoconstrictors work?［J］. Gastroenterol Clin North Am， 2011， 40（3）： 581-598.

2 Tobon GJ， Ca?as C， Jaller JJ， et al. Serious liver disease induced by infliximab［J］. Clin Rheumatol， 2007， 26（4）：578-581.

3 Justo ávila P， Gracia Iguacel C， Ortiz Arduán A， et al. Acute renal failure in patient treated with anti-tumour necrosis factor alpha［J］.Nefrologia， 2011， 31（4）：484-488.

4 Genesca J， Segura R， Gonzalez A， et al. Nitric oxide May contribute to nocturnal hemodynamic changes in cirrhotic patients［J］. Am J Gastroenterol， 2000， 95（6）： 1539-1544.

5 Donate PB， Cunha TM， Verri WA Jr， et al. Bosentan， an endothelin receptor antagonist， ameliorates collagen-induced arthritis： the role of TNF-α in the induction of endothelin system genes［J］. Inflamm Res， 2012， 61（4）： 337-348.

6 Bonthius DJ， Bonthius NE， Li S， et al. The protective effect of neuronal nitric oxide synthase （nNOS） against alcohol toxicity depends upon the NO-cGMP-PKG pathway and NF-kappaB［J］.Neurotoxicology， 2008， 29（6）： 1080-1091.

7 Usui T， Yamawaki H， Kamibayashi M， et al. Mechanisms underlying the anti-inflammatory effects of the Ca2+/calmodulin antagonist CV-159 in cultured vascular smooth muscle cells［J］. J Pharmacol Sci，2010， 113（3）： 214-223.

8 Thurley K， Skupin A， Thul R， et al. Fundamental properties of Ca2+signals［J］. Biochim Biophys Acta， 2012， 1820（8）： 1185-1194.

9 Gerasimenko JV， Lur G， Ferdek P， et al. Calmodulin protects against alcohol-induced pancreatic trypsinogen activation elicited via Ca2+release through IP3 receptors［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 2011，108（14）： 5873-5878.

10 Szatkowski C， Parys JB， Ouadid-Ahidouch H， et al. Inositol 1，4，5-trisphosphate-induced Ca2+ signalling is involved in estradiolinduced breast cancer epithelial cell growth［J］. Mol Cancer， 2010，9：156.

11 T?lle M， Schuchardt M， Wiedon A， et al. Differential effects of uridine adenosine tetraphosphate on purinoceptors in the rat isolated perfused kidney［J］. Br J Pharmacol， 2010， 161（3）： 530-540.