一株以腺嘌呤高效合成ATP的毛霉菌的鑒定

朱家榮，楊善巖，楊光輝，裘娟萍

（浙江工業(yè)大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310032）

一株以腺嘌呤高效合成ATP的毛霉菌的鑒定

朱家榮，楊善巖，楊光輝，裘娟萍

（浙江工業(yè)大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310032）

為確定一株ATP高產(chǎn)毛霉菌ZGB1在分類學(xué)上的地位，通過形態(tài)觀察、生理生化特性分析、18S與ITS r DNA序列比對，對該菌進行鑒定.ZGB1形態(tài)上與放射毛霉屬相似.最適生長溫度為28℃；在PDA培養(yǎng)基中生長對數(shù)期為6～36 h；最適pH為6.5；最適碳氮源分別為葡萄糖和酵母浸膏.18S r DNA序列（Accession No.JN604987）與雅致放射毛霉同源性為99%，ITS r DNA序列（Accession No.JN887460）與 雅 致 放 射 毛 霉 兩 個 亞 種 （Actinomucorelegansvar.strain ATCC52360及Actinomucorelegansstrain CBS111556）同源性皆為100%.鑒定該菌為雅致放射毛霉的突變株，命名為Actinomucorelegansstrain ZGB1.該菌能以腺嘌呤高效合成ATP，當(dāng)腺嘌呤質(zhì)量濃度為3 g／L時，ATP產(chǎn)量可達9.84 g／L，摩爾轉(zhuǎn)化率為80.46%.

毛霉；鑒定；18S r DNA；ITS r DNA

腺嘌呤腺苷三磷酸簡稱ATP，是生命活動所需能量的直接來源，參與生物體內(nèi)多種生化反應(yīng)，在臨床上對癌癥［1］、進行性肌萎縮、中風(fēng)后遺癥、心肌炎、冠狀動脈硬化及肝炎等病癥［2］具一定的輔助治療作用.當(dāng)前國內(nèi)外主要采用生物合成法生產(chǎn)ATP，底物主要有腺嘌呤、腺苷和腺苷一磷酸等.國外主要采用腺嘌呤和腺苷生產(chǎn)ATP日本利用產(chǎn)氨短桿菌（Brevibacteriumammoniagenes）以腺嘌呤為底物生產(chǎn)ATP，轉(zhuǎn)化效率高，生產(chǎn)成本低，處于國際領(lǐng)先水平［3］；國內(nèi)多以腺苷為底物通過酵母菌（Saccha-romyces）發(fā)酵生產(chǎn)ATP，生產(chǎn)成本高、市場競爭力低，所以國內(nèi)的ATP生物合成技術(shù)急需進一步完善提高.采用毛霉菌（Mucor）以腺嘌呤為底物合成ATP的工藝之前國內(nèi)已有報道，但存在產(chǎn)量及摩爾轉(zhuǎn)化率較低等問題［4］，尚需進一步優(yōu)化提高.毛霉菌具有豐富的酶系，采用毛霉菌進行ATP的合成具有菌體生長迅速、工藝簡單和反應(yīng)時間短等優(yōu)點；而且相比腺苷與腺苷一磷酸，以腺嘌呤為底物具有原料成本低和質(zhì)量轉(zhuǎn)化率高（質(zhì)量轉(zhuǎn)化率約是腺苷的2倍）等優(yōu)點.因此，該工藝具有較高的經(jīng)濟價值及廣闊的應(yīng)用前景.

實驗發(fā)現(xiàn)課題組保藏的一株毛霉菌——ZGB1具有較強的磷酸化系統(tǒng)，能以腺嘌呤為底物合成ATP，而且通過實驗探索使ATP產(chǎn)量有了一定的提高，但要進行深入的研究，就必須對其進行準確的分類鑒定，確定其在分類學(xué)中的地位.當(dāng)前分子生物學(xué)發(fā)展迅速，人們已認識到單靠傳統(tǒng)的形態(tài)及生理生化特性為指標，已不足以對絲狀真菌的鑒定 提 供 充 分 有 力 的 證 據(jù)［5－6］，18S與ITS r DNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于絲狀真菌的鑒定中.筆者通過18S與ITS r DNA序列分析、系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建結(jié)合絲狀真菌傳統(tǒng)的分類鑒定方法，對實驗所用毛霉菌ZGB1進行了分類鑒定，確定該菌為雅致放射毛霉（Actinomucorelegans）的突變株.為下一步通過誘變育種、代謝調(diào)控及基因工程等途徑提高該菌ATP產(chǎn)量奠定了基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 菌 種

Mucor：實驗室篩選得到，編號ZGB1，以下簡稱ZGB1.

1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g／L，蔗糖20 g／L，瓊脂20 g／L，pH自然.

察氏培 養(yǎng)基：蔗糖 30 g／L，Na NO32 g／L，K2HPO4·3H2O 1 g／L，MgSO4·7H2O 0.5 g／L，KCl 0.5 g／L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g／L，瓊脂20 g／L，pH自然.

1.3 主要試劑

PCR試劑盒，PCR產(chǎn)物純化試劑盒，p MD19-T simple vecto購于 Takara公司；T4－DNA Ligase，RNase，DL 2 000，1 kb marker plus，均購于 Ta Ka-Ra公司.其他常用試劑為國產(chǎn)生化或分析純試劑.

1.4 方 法

1.4.1 菌株的分離純化

將ZGB1活化培養(yǎng)后，制備孢子懸液稀釋涂布PDA平板，于30℃培養(yǎng)12～18后挖取單菌落，置于新的PDA平板，繼續(xù)培養(yǎng)至孢子成熟.如此重復(fù)進行2～3次分離，可將該菌分離純化.

1.4.2 形態(tài)鑒定

將ZGB1孢子點種于PDA平板，30℃培養(yǎng)，每12 h觀察記錄菌落形態(tài)；用載玻片培養(yǎng)法（30℃恒溫培養(yǎng)）進行菌株的顯微鏡檢.

1.4.3 生理生化特性考察

以PDA培養(yǎng)基確定ZGB1生長最適溫度與pH，并作生長曲線.以察氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，確定最適碳源及氮源.液體培養(yǎng)接種以O(shè)D600＝1.0的孢子懸液，按體積分數(shù)為10%的接種量接種.

1.4.4 分子鑒定

氯化芐法提取 ZGB1基因組 DNA［7－9］，以真菌18S通用引物（18SU：5′-AGCCATGCATGTCTAAGTATAAGC-3′；18SL：5′-ACAAAGGGCAGGACGTAATCAAC-3′），ITS 通 用 引 物 （ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS2：5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）進 行 PCR 擴 增.PCR 體 系：10×PCR buffer 5.0 μL，d NTPs 4.0μL，MgCl23.0μL，正反引物各1.0μL，模板1.0μL，Taq酶1.0μL，dd H2O 補充至50.0μL.PCR程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s（ITS為1 min），52℃退火1 min（ITS為55℃退火30 s），72℃延伸45 s（ITS為延伸1 min），30個循環(huán)；72℃延伸10 min.PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分別回收目的片段，并 T／A 克隆至p MD19-T simple vector，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，經(jīng)藍白斑篩選獲得轉(zhuǎn)化子［10］，測序由生工生物工程（上海）有限公司完成.利用MEGA4.1，構(gòu)建ZGB1系統(tǒng)發(fā)育進化樹.

1.4.5 ATP產(chǎn)量測定

ZGB1孢子懸液接種PDA液體培養(yǎng)基，于28℃、160 r／min培養(yǎng)36 h，抽濾獲得菌體，65℃干燥3 h，即為有轉(zhuǎn)化活性的菌體.轉(zhuǎn)化體系：葡萄糖120 g／L，Na2HPO4·12H2O 90 g／L，MgCl2·6H2O 4 g／L，腺嘌呤3 g／L，菌體100 g／L.配好的反應(yīng)體系攪拌均勻后，于33℃，160 r／min的搖床中轉(zhuǎn)化.反應(yīng)6 h開始每隔2 h用紙電泳檢測轉(zhuǎn)化情況，14 h終止反應(yīng).

ATP的分析測定，參照孫培龍、吳石金《紙電泳法定量分析腺苷三磷酸》［11］.點樣5μL于1.5 cm寬的普通濾紙條，以檸檬酸－檸檬酸鈉溶液（檸檬酸9 g／L，檸檬酸鈉1 g／L）為緩沖液，電壓400 V，電泳50 min.電泳結(jié)束烘干濾紙條，于紫外分析儀下描出ATP斑點，剪成細條，以pH為1的HCl溶液于30℃，160 r／min搖床中浸提4 h，測定浸提液OD260.ATP產(chǎn)量計算公式為

式中：MrATP＝551 g／mol；C為稀釋倍數(shù)（浸提液體積／點樣體積）；EATP＝1.43×104L／（mol·cm）.

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)特征

用無菌接種針將ZGB1孢子點種于PDA平板，30℃培養(yǎng)，每12 h觀察記錄菌落形態(tài)，結(jié)果如表1所示.

2.2 菌株形態(tài)特征

2.2.1 菌 絲

ZGB1菌絲無色、無橫隔，分為營養(yǎng)菌絲和氣生菌絲.如圖1（a）所示，營養(yǎng)菌絲較細、彎曲且多分支，潛入培養(yǎng)基內(nèi)生長，并分化出匍匐菌絲及假根.如圖1（b）所示，氣生菌絲于假根處生出直立生長、單生或總狀分枝，直徑8.0～11.0μm.這些特征與毛霉屬的總狀枝毛霉、放射毛霉屬及根霉屬相似.

表1 ZGB1菌落形態(tài)的特征Table 1 Colony feature of ZGB1

2.2.2 孢囊梗

孢囊梗是支持孢子囊的菌絲分枝，不同種屬的霉菌孢囊梗具有一定的差異.如圖1（c）所示，ZGB1孢囊梗由氣生菌絲直接生出，輪生放射狀，頂生孢子囊，有橫隔，色澤同氣生菌絲，直徑為10.5～26.3 μm.其中孢囊梗輪生放射狀、頂生孢子囊是放射毛霉屬的典型特征［12］.

圖1 菌絲及孢囊梗Fig.1 Hypha and sporangiophore

2.2.3 孢子囊

孢子囊是某些霉菌發(fā)育到一定階段，由氣生菌絲或孢囊梗頂端膨大形成的“囊狀”的，內(nèi)含孢囊孢子的特殊結(jié)構(gòu).如圖2（a，b）所示，ZGB1孢子囊呈球形或洋犁形、表面絨毛狀、黃褐色、囊壁粗糙，成熟后囊壁消解釋放出孢囊孢子，孢子囊形狀與毛霉屬的多數(shù)種及放射毛霉屬相似；孢子囊直徑30.0～70.0 μm，這與放射毛霉屬及毛霉屬的總狀枝毛霉、凍土毛霉、易脆毛霉相似.

2.2.4 囊 軸

囊軸又稱囊柱或中軸，是孢囊梗的一種延伸，孢子囊成熟后，有些霉菌的囊壁會消解，釋放出孢囊孢子，露出囊軸.但只有霉菌的某些特定種屬具有囊軸結(jié)構(gòu).如圖2（c）所示，ZGB1的囊軸無色光滑，圓形或卵圓形，直徑25.0～60.0μm，有囊領(lǐng)、無囊托，這與放射毛霉屬及毛霉屬的分散毛霉、閃孢毛霉類似.

2.2.5 孢囊孢子

某些霉菌發(fā)育到一定階段，孢子囊形成后，囊中的核經(jīng)多次分裂，形成大量密集的有原生質(zhì)包裹的核，然后生出各自的孢子壁，形成一個個的孢子.這種孢子形成于囊狀結(jié)構(gòu)的孢子囊中，因而得名孢囊孢子，該孢子為無性孢子.如圖3（a）所示，ZGB1孢囊孢子呈短卵形或球形，直徑7.9～24.0μm，略透 明，表面光滑.

2.2.6 厚垣孢子

圖3（b）為 ZGB1的厚垣孢子，直徑10.5～21.0μm.厚垣孢子屬無性孢子，很多霉菌都能形成這類孢子.其形成過程是：在氣生菌絲或孢囊梗中某處膨大、原生質(zhì)濃縮、變圓，類脂物質(zhì)密集，然后生出厚壁或原細胞壁增厚，形成圓形或紡錘形的厚垣孢子.它是霉菌抵抗不良環(huán)境條件，產(chǎn)生的一種休眠體，當(dāng)菌絲體死亡后，其厚垣孢子還能存活很久，當(dāng)遇到適宜條件時又可萌發(fā)成菌絲體［13］.

2.2.7 節(jié)生孢子

節(jié)生孢子又叫粉孢子，是菌絲生長到一定階段產(chǎn)生的一種卵圓形、成串如念珠狀的結(jié)構(gòu)，屬無性孢子范疇［13］.如圖3（c）所示，ZGB1的節(jié)生孢子直徑7.9～13.2μm.

根據(jù)以上實驗結(jié)果，參照魏景超《真菌鑒定手冊》［14］及鄭儒永［15］、Khan Z U［12］等報道，從形態(tài)上將ZGB1與其他絲狀真菌進行了分析比較，初步鑒定ZGB1屬于毛霉科（Mucoraceae）的放射毛霉屬（Actinomucor）.

2.3 生理生化特性

2.3.1 最適溫度

將ZGB1孢子點種PDA平板，分別于22，25，28，31，34，37，40℃恒溫培養(yǎng)，測48 h時菌落直徑，確定溫度對其生長的影響.結(jié)果如圖4所示，該菌最適生長溫度為28℃，此溫度下生長旺盛菌絲潔白，菌叢較高；37℃生長受抑制菌叢稀疏低矮；40℃完全不生長.這與總狀枝毛霉及布氏毛霉相似.

圖4 溫度對ZGB1生長的影響Fig.4 Effect of temperature on the growth of ZGB1

2.3.2 最適pH

分別配制初始pH 為5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0的液體PDA培養(yǎng)基，接種ZGB1孢子，每樣三個平行.于28℃，180 r／min培養(yǎng)24 h，抽濾收集菌體，65℃烘干至恒重，稱量并計算菌體產(chǎn)量.結(jié)果如圖5所示，當(dāng)初始pH為6.5時ZGB1生長良好，菌體產(chǎn)量最高；當(dāng)初始pH小于6.5時，ZGB1菌體產(chǎn)量隨pH的提高而增加；初始pH超過6.5后菌體產(chǎn)量呈下降趨勢.所以，ZGB1生長的最適初始pH在6.5左右.

圖5 pH對ZGB1生長的影響Fig.5 Effect of pH on the growth of ZGB1

2.3.3 生長曲線

將ZGB1孢子懸液接種PDA液體培養(yǎng)基，于28℃，180 r／min培養(yǎng).每隔6 h取3瓶，抽濾收集菌體，65℃烘干至恒重稱量，并計算菌體產(chǎn)量作生長曲線.如圖6所示，PDA培養(yǎng)基中對數(shù)生長期在6～36 h；穩(wěn)定期大約在36～66 h（此時菌體產(chǎn)量可達2.64 g／L）；66 h開始進入衰亡期，此時菌體量不再增加，反而呈略微下降的趨勢.

圖6 ZGB1生長曲線Fig.6 The growth curve of ZGB1

2.3.4 最適碳源

以察氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以乳糖、葡萄糖、糖蜜、半乳糖、淀粉、果糖和蔗糖為碳源，制備培養(yǎng)基并接種ZGB1孢子，每樣三個平行.于28℃，180 r／min培養(yǎng)48 h，抽濾收集菌體，65℃烘干至恒重，并計算菌體產(chǎn)量.結(jié)果如圖7所示，ZGB1對單糖的利用率要高于雙糖，對淀粉利用率最差，而且在單糖中以葡萄糖為佳.

2.3.5 最適氮源

以察氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以NaNO3、酵母膏、蛋白胨、NH4NO3、黃豆粉、牛肉膏和CO（NH2）2為氮源，制備培養(yǎng)基接種ZGB1孢子，每樣三個平行.于28℃，180 r／min培養(yǎng)48 h，抽濾收集菌體，65℃烘干至恒重測其質(zhì)量.結(jié)果如圖8所示，ZGB1對有機氮源利用率要高于無機氮源，且以酵母浸膏為佳.

2.4 分子鑒定

圖9 ZGB1的18S與ITS r DNA序列Fig.9 18S and ITS r DNA sequences of ZGB1

如圖9所示，以18S和ITS通用引物進行PCR擴增，分別得到約1.5 kb和略小于750 bp的片段.回收目的片段，測序明確其大小分別為1 522 bp和718 bp.序列提交Gen Bank數(shù)據(jù)庫注冊，獲得登錄號分別為JN604987和JN887460.

將兩序列分別在NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST比對，ZGB1的18S rDNA序列與雅致放射毛霉相似度達99%；而ITS rDNA序列與雅致放射毛霉的兩個亞種（Actinomucorelegansvar.strain ATCC52360及Ac-tinomucorelegansstrain CBS111556）相似度均為100%.分別從比對結(jié)果中選取相似度最高的菌株，用MEGA4.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.如圖10，11所示，18S r DNA系統(tǒng)發(fā)育樹中ZGB1與雅致放射毛霉位于同一分支，親緣關(guān)系最近.ITS r DNA系統(tǒng)發(fā)育樹中，ZGB1與雅致放射毛霉的兩個亞種（Actinomucorelegansvar.strain ATCC52360及Actinomucor elegansstrain CBS111556）親緣關(guān)系最近.

2.5 ATP合成能力測定

用該菌以腺嘌呤為底物進行ATP的合成，反應(yīng)液進行紙電泳檢測，考察其ATP合成水平.圖12為反應(yīng)10 h時的紙電泳結(jié)果，在紫外透射儀下可以看到ATP及腺嘌呤斑點，ATP與腺嘌呤分別于點樣點兩側(cè)，向相反方向遷移.

圖12 反應(yīng)產(chǎn)物紙電泳Fig.12 Paper electrophoresis of reaction product

如圖13所示，當(dāng)腺嘌呤投加量為3 g／L時，反應(yīng)10 h時ATP產(chǎn)量達到最大，最大值為9.84 g／L，摩爾轉(zhuǎn)化率（實際產(chǎn)量與理論產(chǎn)量的物質(zhì)的量之比）為80.46%.此后，反應(yīng)液中的ATP含量隨時間的增加降低，其原因可能是反應(yīng)液內(nèi)葡萄糖耗盡，不能再為腺嘌呤到ATP的轉(zhuǎn)化反應(yīng)提供能量，反應(yīng)變?yōu)橐阅娣磻?yīng)為主，反應(yīng)液中的ATP被逐漸消耗，同時在腺嘌呤與點樣點之間會出現(xiàn)ADP及AMP斑點.

3 結(jié) 論

根據(jù)形態(tài)特征、生理生化特性、18S與ITS r DNA序列比對結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹分析，鑒定該菌為雅致放射毛霉的突變株，命名為Actinomucorelegansstrain ZGB1.該菌在分類學(xué)中的地位為真菌門（Fungi）、藻菌綱（Phycomycetes）、毛霉目（Mucorales）、毛霉科（Mucoraceae）、放射毛霉屬（Actinomucor）和雅致放射毛霉（Actinomucorelegans）.雅致放射毛霉，又名匍匐放射毛霉，是腐乳釀造中的常用菌種之一［16］.該菌具有豐富的酶系，能分泌胞內(nèi)酶和胞外酶，能用于制備氨肽酶［17］、蛋白酶［18］及神經(jīng)酰胺［19］等，是一株極具應(yīng)用價值的菌株.另外，該菌磷酸化系統(tǒng)較強，能以腺嘌呤為底物合成ATP，腺嘌呤投加量為3 g／L時，ATP產(chǎn)量可達9.84 g／L，腺嘌呤到ATP的摩爾轉(zhuǎn)化率為80.46%.目前該工藝尚存在腺嘌呤轉(zhuǎn)化不徹底的問題，尤其是當(dāng)腺嘌呤投加量增大時，腺嘌呤到ATP的轉(zhuǎn)化率呈下降趨勢，所以該工藝轉(zhuǎn)化條件及補料方法尚需進一步優(yōu)化，另外可通過理化誘變以及基因工程技術(shù)對該菌進行改造，構(gòu)建以腺嘌呤合成ATP的高產(chǎn)菌株，這些都需要建立在明確該菌在分類學(xué)中地位、了解其生理生化特性的基礎(chǔ)之上，所以該菌的鑒定工作十分必要.

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Identification of aMucoroverproducing ATP from adenine

ZHU Jia-rong，YANG Shan-yan，YANG Guang-hui，QIU Juan-ping
（College of Biological and Environmental Engineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310032，China）

To determine the status of aMucorZGB1 in taxonomy，which can efficiently synthesise ATP，it was identified based on morphological observation，physiological and biochemical property analysis，18S and ITS r DNA sequence analysis.The optimum temperature for growth was 28℃.The range of its log growth phase was 6～36 h.The adequate pH was 6.5.The optimum carbon was glucose.Its optimum nitrogen source was yeast extract.The homology of 18S r DNA sequences（Accession No.JN604987）ofMucorZGB1 withActinomucoreleganswas 99%.The homology of ITS r DNA sequences（Accession No.JN887460）ofMucorZGB1 with two subunits ofActinomucorelegans（Actinomucorelegansvar.strain ATCC52360 andActinomucor elegansstrain CBS111556）was 100%.So ZGB1 was identified as one mutant strain ofActinomucorelegansand namedActinomucorelegansstrain ZGB1.9.84 g／L ATP was accumulated from 3 g／L adenine and the molar conversion ratio was 80.46%.

Mucor；identify；18S r DNA；ITS r DNA

Q939.97

A

1006-4303（2013）02-0171-07

2012-02-20

朱家榮（1954—），男，上海人，副教授，研究方向為應(yīng)用微生物學(xué)，E-mail：zjzjr＠zjut.edu.cn.

（

陳石平）