基于荷移反應(yīng)的HPLC法測(cè)定L－半胱氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)

王 笑，侯曉蓉，王建偉，申屠超，單偉光

（1.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310032；2.浙江樹(shù)人大學(xué)，浙江 杭州 310015）

基于荷移反應(yīng)的HPLC法測(cè)定L－半胱氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)

王 笑1，侯曉蓉1，王建偉1，申屠超2，單偉光1

（1.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310032；2.浙江樹(shù)人大學(xué)，浙江 杭州 310015）

建立基于荷移反應(yīng)的L－半胱氨酸高效液相色譜（HPLC）定量方法.在pH 9.0的硼酸－硼砂緩沖溶液中，L-半胱氨酸與四氯苯醌于40℃水浴中恒溫30 min，形成絡(luò)合物（λmax＝358 nm），采用高效液相色譜進(jìn)行分析.結(jié)果表明：L-半胱氨酸與四氯苯醌形成了摩爾比為1∶1型穩(wěn)定絡(luò)合物.另外，L-半胱氨酸在5～100μg／mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系；低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的加樣回收率分別為99.2%，99.1%和96.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.3%，1.4%和1.3%.本方法準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便且重復(fù)性良好，適用于L－半胱氨酸原料藥的定量分析.

荷移反應(yīng)；高效液相色譜；L-半胱氨酸；四氯苯醌

半胱氨酸是一種天然的，含有一個(gè)巰基基團(tuán)的氨基酸，其類(lèi)似物在一些生物進(jìn)程中起著不可忽視的作用［1］.國(guó)內(nèi)外研究表明半胱氨酸有多種生物學(xué)作用，參與許多重要的細(xì)胞代謝過(guò)程，包括蛋白質(zhì)合成、解毒和新陳代謝等.缺乏半胱氨酸容易引起一系列綜合癥，包括兒童生長(zhǎng)緩慢、頭發(fā)脫色、水腫、肝損傷、皮膚病變等［2－3］.因此，半胱氨酸的質(zhì)量控制方法有待進(jìn)一步探索.

目前，測(cè)定半胱氨酸含量的方法主要有柱前衍生化 HPLC－MC［4］、毛細(xì)管電泳法［5］、熒光法［6－9］、電化學(xué)測(cè)定法［10］和伏安法［11－12］等.由于 L－半胱氨酸在紫外區(qū)無(wú)吸收，故在HPLC檢測(cè)中主要采用熒光檢測(cè)器.荷移光譜法提出于20世紀(jì)50年代，是根據(jù)Mulliken［13］在量子化學(xué)基礎(chǔ)上提出的電荷轉(zhuǎn)移理論發(fā)展起來(lái)的一種分析方法，并于1972年作為一個(gè)標(biāo)題引入化學(xué)文獻(xiàn).它利用含有能夠提供電子的n-電子基團(tuán)或π－電子基團(tuán)的藥物與電子受體試劑形成荷移絡(luò)合物.生成的荷移絡(luò)合物往往在紫外或可見(jiàn)區(qū)具有特定的吸收峰，利用這些特性可以建立起荷移光譜法來(lái)測(cè)定藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù).由于荷移絡(luò)合物的形成，使吸收光譜發(fā)生較大幅度的紅移，從而避開(kāi)藥物制劑或體液中其他物質(zhì)的干擾，使其選擇性顯著提高，所以近年來(lái)荷移光譜法在藥物分析方面得到廣泛的應(yīng)用.

將電子荷移理論引入高效液相色譜法的柱前衍生化，并研究了L－半胱氨酸與四氯苯醌形成荷移絡(luò)合物的條件，建立了基于荷移反應(yīng)的高效液相色譜法測(cè)定L－半胱氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的新方法.該方法操作條件易得、準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便且重復(fù)性好，利用普遍應(yīng)用于分析測(cè)試的UV檢測(cè)器，干擾少，選擇性高，結(jié)果令人滿意，可用于測(cè)定L－半胱氨酸原料藥的質(zhì)量分?jǐn)?shù).目前基于荷移反應(yīng)的半胱氨酸高效液相色譜法測(cè)定方法還未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，該方法也為無(wú)紫外吸收的該類(lèi)藥物的高效液相色譜法測(cè)定提供了新方法.

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀（配備G1314紫外檢測(cè)器，G1311A在線脫氣裝置，G1329A進(jìn)樣器）（美國(guó)Agilent公司）；UV-2450紫外／可見(jiàn)分光光度儀（日本Shimadzu公司）；ZNHW-II型精密電子控制儀（杭州大衛(wèi)科教儀器有限公司）.

L－半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（98.5%，上海國(guó)藥試劑公司）；四氯苯醌（TCBQ）、對(duì)苯醌（p-BQ）、2，3-二氯－5，6-二氰對(duì)苯醌（DDBQ）為化學(xué)純；無(wú)水乙醇、醋酸、硼砂、硼酸、磷酸氫二鈉、檸檬酸為分析純；甲醇為色譜純；實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水.

1.2 溶液制備

L－半胱氨酸對(duì)照品溶液.準(zhǔn)確稱(chēng)取L-半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)品0.050 0 g，溶于50 mL蒸餾水，制得1 000 mg／L的對(duì)照品儲(chǔ)備液.使用時(shí)稀釋至所需質(zhì)量濃度.

TCBQ溶液.準(zhǔn)確稱(chēng)取四氯苯醌0.024 6 g，超聲輔助溶于100 mL蒸餾水，制得1.0 mmol／L四氯苯醌溶液.

緩沖溶液.準(zhǔn)確配制19.07 g／L硼砂溶液和12.37 g／L 硼酸溶液，取硼砂溶液8.0 mL 加入2.0 mL硼酸溶液中，制得pH 9.0的緩沖溶液.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

在10 mL比色管中依次加入1 mL L－半胱氨酸溶液，1 mL的硼砂－硼酸緩沖溶液（pH 9.0）和2 mL四氯苯醌溶液（1.0 mmol／L），用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，置于40℃水浴中反應(yīng)30 min后，迅速冷卻至室溫，用高效液相色譜進(jìn)行分析.

樣品分離采用Agilent?Eclipse XDBTMC18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm），柱溫25℃.流動(dòng)相組成為30%甲醇和70%三乙胺水溶液（0.005%），流速1.0 mL／min.檢測(cè)波長(zhǎng)為358 nm，進(jìn)樣體積為10μL.在上述條件下，L-半胱氨酸和絡(luò)合物的保留時(shí)間分別為2.4 min和6.5 min.

2 結(jié)果與討論

2.1 L-半胱氨酸與TCBQ的反應(yīng)

L-半胱氨酸與三種荷移試劑（TCBQ，p-BQ，DDBQ）的荷移反應(yīng)表明，L-半胱氨酸與TCBQ發(fā)生荷移反應(yīng)的靈敏度最高，因此本實(shí)驗(yàn)采用TCBQ作為荷移試劑.根據(jù)TCBQ的紫外吸收光譜（圖1），其在287 nm處具有最大吸收；而L－半胱氨酸與TCBQ反應(yīng)后，在相同條件下的最大吸收波長(zhǎng)變化為358 nm，發(fā)生了紅移現(xiàn)象，說(shuō)明兩者之間發(fā)生了反應(yīng)，形成了在紫外區(qū)具有特征吸收峰的穩(wěn)定荷移絡(luò)合物.

圖1 四氯苯醌和荷移絡(luò)合物的紫外吸收光譜Fig.1 Absorption spectra of TCBQ and charge transferring complex

在相同條件下，選用甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、二甲基亞砜和水為溶劑進(jìn)行試驗(yàn).結(jié)果顯示：L-半胱氨酸和TCBQ在水中反應(yīng)最完全，色譜峰面積最大.因此，選用水為溶劑.在上述實(shí)驗(yàn)條件下，利用高效液相色譜檢測(cè)參比溶液和該荷移絡(luò)合物，得到如圖2所示的液相色譜圖.

圖2 荷移絡(luò)合物的液相色譜圖Fig.2 HPLC spectra of charge transferring complex

2.2 反應(yīng)條件的影響和優(yōu)化

反應(yīng)pH 采用硼砂－硼酸（pH 7.0～9.0）和碳酸鈉-碳酸氫鈉（pH 10.0～11.0）緩沖液控制.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：L-半胱氨酸與TCBQ在pH 9.0時(shí)具有最高的反應(yīng)率，并且在該pH下，反應(yīng)具有較高的靈敏度，且峰面積穩(wěn)定.同時(shí)，該體系對(duì)反應(yīng)影響小.

在不同的緩沖液用量下，反應(yīng)所得的絡(luò)合物峰面積大小幾乎保持恒定.因此，反應(yīng)體系選用pH 9.0的硼砂－硼酸緩沖體系（0.2 mol／L），用量為1 mL.

反應(yīng)的溫度對(duì)絡(luò)合物的形成與穩(wěn)定沒(méi)有顯著的影響，在40～50℃范圍內(nèi)，反應(yīng)效率略高.而反應(yīng)時(shí)間對(duì)絡(luò)合物的形成有顯著影響，反應(yīng)經(jīng)過(guò)30 min后，絡(luò)合物的峰面積大小基本趨于穩(wěn)定.故選擇的反應(yīng)溫度為40℃，反應(yīng)時(shí)間為30 min.

另外，還考察了TCBQ用量對(duì)反應(yīng)的影響.結(jié)果表明：TCBQ溶液（1.0 m mol／L）的用量在1.5～4.0 mL內(nèi)，反應(yīng)完全，且TCBQ用量對(duì)測(cè)定幾乎無(wú)影響.因此，選用TCBQ用量為2.0 mL.

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

待反應(yīng)完成后，用HPLC測(cè)定不同放置時(shí)間的反應(yīng)液.結(jié)果表明，反應(yīng)液中荷移絡(luò)合物穩(wěn)定性良好，放置12 h后，峰面積沒(méi)有明顯變化；7 d的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差僅為5.4%.

標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示，將數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理得回歸方程A＝13.544C（其中A為峰面積，C為L(zhǎng)－半胱氨酸的質(zhì)量濃度），線性相關(guān)系數(shù)r2＝0.999 7，線性范圍為0～100 mg／L.最低檢測(cè)限為0.2 mg／L；最低定量限為1.0 mg／L.

根據(jù)HPLC測(cè)定，L-半胱氨酸在原料藥中質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95.7%.另外，該方法的回收率及精密度采用加樣法檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表1.

圖3 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve

表1 樣品的回收率及精密度測(cè)定結(jié)果（n＝5）Table 1 Determination results of recovery and RSD of sample（n＝5）

2.4 絡(luò)合物組成和穩(wěn)定常數(shù)測(cè)定

用連續(xù)變化法（圖4a）和摩爾比法（圖4b）測(cè)定絡(luò)合物的組成，其中C1和C2分別為L(zhǎng)－半胱氨酸和TCBQ物質(zhì)的量濃度，測(cè)得L－半胱氨酸與TCBQ的絡(luò)合摩爾比為1∶1.L－半胱氨酸分子中N原子上有一孤對(duì)電子對(duì)可作為電子供體，而TCBQ作為n電子受體，在水中可形成n-π型絡(luò)合物.基于測(cè)得的絡(luò)合物組成摩爾比為1∶1，荷移反應(yīng)式為

圖4 檢測(cè)絡(luò)合物穩(wěn)定性Fig.4 The stability of charge transferring complex

用稀釋法測(cè)定絡(luò)合物的穩(wěn)定常數(shù)，在兩個(gè)不同的L－半胱氨酸和TCBQ總摩爾數(shù)條件下，在同一坐標(biāo)上分別作對(duì)兩個(gè)不同總摩爾分?jǐn)?shù)溶液的吸光度曲線（曲線Ⅰ和曲線Ⅱ），其中X v表示四氯苯醌的摩爾數(shù)和溶液總摩爾數(shù)的比值，在這二條曲線上找出吸光度相同的二點(diǎn)，如圖5所示，則在此二點(diǎn)上對(duì)應(yīng)的溶液的絡(luò)合物濃度應(yīng)相同，由此得出絡(luò)合物穩(wěn)定常數(shù)K＝2.887×103／（mol·L）.

圖5 吸光度－溶液組成圖Fig.5 Spectrophotometry-solution composition

3 結(jié) 論

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)可知：基于荷移反應(yīng)的L-半胱氨酸高效液相色譜定量法，操作簡(jiǎn)便、可靠且靈敏度高，可用于L-半胱氨酸原料藥的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定及其合成工藝中的中間控制.

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Quantification of L-cysteine by HPLC based on charge transfer reaction

WANG Xiao1，HOU Xiao-rong1，WANG Jian-wei1，SHEN-TU Chao2，SHAN Wei-guang1
（1.College of Pharmaceutical Science，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310032，China；2.Zhejiang Shuren University，Hangzhou 310015，China）

A method of high performance liquid chromatography（HPLC）was established for quantification of L-cysteine based on charge transfer reaction. L-cysteine reacts with tetrachloroquinone in pH 9.0 borax-boric acid buffer at 40℃for 30 min，forming a complex（λmax＝358 nm），which could be detected using HPLC.The results indicated that stable complex formed with an L-cysteine／tetrachloroquinone molar ratio of 1∶1.Moreover，the determination fell into an excellent linear relation in the range of 10～150μg／mL.The recoveries were 99.2%，99.1%and 96.5%，and the relative standard deviations（RSD）were 1.3%，1.4%and 1.3%for low，middle and high three kinds added，respectively.This method is accurate，quick，simple and reproducible and can be used to quantify L-cysteine in crude drug.

charge transfer reaction；high performance liquid chromatography （HPLC）；L-cysteine；tetrachloroquinone

R917

A

1006-4303（2013）02-0152-04

2012-03-12

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（Y2080137）；浙江省科技廳公益計(jì)劃研究社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目（2011C23006）

王 笑（1988—），女，浙江東陽(yáng)人，碩士研究生，研究方向?yàn)閮x器分析，E-mail：hoverxiaoxiao＠hotmail.com.通信作者：?jiǎn)蝹ス饨淌冢珽-mail：swg＠zjut.edu.cn.

（

陳石平）