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    高遷移率族蛋白B1對激素難治性前列腺癌冷凍免疫反應(yīng)的影響

    2013-08-22 11:11:44劉長富司同國邢文閣于海鵬
    介入放射學(xué)雜志 2013年6期
    關(guān)鍵詞:消融活化比例

    劉長富,郭 志,司同國,邢文閣,劉 方,于海鵬

    高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1,HMGB1)是一種存在于真核生物細(xì)胞內(nèi)的非組蛋白染色體結(jié)合蛋白,參與包括基因轉(zhuǎn)錄、DNA修復(fù)等多種生物學(xué)過程[1-2],釋放至細(xì)胞外的HMGB1可作為內(nèi)源性免疫調(diào)節(jié)因子,影響免疫反應(yīng)的啟動和激烈程度[3-4]。相關(guān)研究顯示,HMGB1在多種腫瘤細(xì)胞中呈高表達[1,5-7],冷凍消融治療是否能在導(dǎo)致大量腫瘤細(xì)胞壞死的同時使腫瘤細(xì)胞內(nèi)的HMGB1釋放至細(xì)胞外,這些釋放的HMGB1是否能促進樹突狀細(xì)胞(DC)數(shù)量增加及增高其活化程度,進而對冷凍免疫反應(yīng)產(chǎn)生影響,目前尚少見相關(guān)研究報道。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞系及實驗動物皮下移植瘤模型建立

    小鼠前列腺癌細(xì)胞 (RM-1)株由上海中科院細(xì)胞庫提供。清潔級純種近交系C57BL/6(H-2Db/b)雄性小鼠50只,6~8周齡,體重18~22 g,購自中國科學(xué)院天津血液病研究所實驗動物中心。取對數(shù)生長期的RM-1細(xì)胞,調(diào)細(xì)胞濃度至5×106個/ml。取雄性C57BL/6小鼠,用1 ml注射器將0.1 ml腫瘤細(xì)胞接種于右腹股溝皮下,每3 d觀察腫瘤生長情況。

    1.2 實驗分組

    將50只RM-1細(xì)胞激素非依賴性前列腺癌模型小鼠隨機分為對照組25只,不予任何治療;治療組25只,給予冷凍消融治療。

    1.3 氬氦冷凍消融治療技術(shù)操作步驟

    接種腫瘤后第2周(腫瘤直徑約1 cm),于荷瘤鼠腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛(3.5 ml/kg)麻醉后,仰臥固定于操作臺上。采用的氬氦冷凍消融系統(tǒng)(CryocareTMSurgical System)為美國Endocare公司產(chǎn)品。右側(cè)腹股溝處常規(guī)消毒、鋪巾,在瘤旁切一小口,直視下將直徑1.7 mm的氬氦冷凍探針刺入腫瘤組織內(nèi)6~8 mm。啟動氬氣,工作壓力17 225 kPa(2 500 psi),初始功率均為20%條件下,冷凍時間為30 s,冰球完全覆蓋腫瘤,可見腫物表面完全覆蓋凍霜,中央溫度可達-120℃,啟動氦氣復(fù)溫至10℃,為第1個冷凍循環(huán)。同樣方法重復(fù)第2個冷凍循環(huán)。冷凍治療結(jié)束后拔出冷凍器,縫合皮膚。

    1.4 標(biāo)本采集

    兩組分別于治療前、治療后1、7、14、21 d各取5只小鼠,無菌條件下,取腫瘤組織并制備單細(xì)胞懸液。

    1.5 Western印跡及流式細(xì)胞儀檢測

    采用Western印跡法檢測不同時間點腫瘤局部組織中HMGB1表達情況,Western印跡反應(yīng)結(jié)果應(yīng)用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司,美國)照相記錄,應(yīng)用QuantityOne Basic軟件進行條帶灰度掃描,計算積分吸光度(IA)值。收集的細(xì)胞懸液混勻后,分別取100 μl加入離心管,分別標(biāo)定為CD11c、CD86、CD80,同時設(shè)標(biāo)準(zhǔn)對照管,應(yīng)用流式細(xì)胞儀(BD公司,美國)檢測細(xì)胞表面抗體的表達情況。

    1.6 統(tǒng)計方法

    采用SPSS13.0軟件包進行數(shù)據(jù)分析。將數(shù)據(jù)統(tǒng)一編碼后,錄入EXCEL數(shù)據(jù)庫,數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差 (±s)表示。組內(nèi)不同時間點的比較采用ANOVA方差分析、各時間點兩組之間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗、相關(guān)性分析采用Pearson檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 治療前、后腫瘤局部組織中HMGB1表達

    與術(shù)前比較,治療組術(shù)后第7天腫瘤局部組織中HMGB1表達水平顯著增高(P<0.01),隨時間延長逐漸下降,至術(shù)后21 d恢復(fù)至術(shù)前水平 (P>0.05)。對照組腫瘤局部HMGB1表達水平無明顯改變,各時間點之間比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P>0.05)。相同時間點腫瘤局部HMGB1表達水平在術(shù)后1、7、14 d治療組均高于對照組,組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0.01)。 見表1 和圖1。

    2.2 治療前、后腫瘤局部浸潤DC細(xì)胞比例變化

    表1 術(shù)后腫瘤局部HMGB1蛋白表達水平變化 (n=5,±s)

    表1 術(shù)后腫瘤局部HMGB1蛋白表達水平變化 (n=5,±s)

    注:a與術(shù)前比較 P < 0.05;b與對照組比較 P < 0.05

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    圖1 治療組術(shù)后腫瘤局部HMGB1表達水平

    與術(shù)前比較,治療組術(shù)后第7天腫瘤局部組織中DC細(xì)胞比例顯著增高(P<0.01),隨時間延長逐漸下降,至術(shù)后 21 d恢復(fù)至術(shù)前水平(P >0.05)。對照組腫瘤局部DC細(xì)胞比例無明顯改變,各時間點之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。治療組術(shù)后1、7、14 d相同時間點腫瘤局部DC細(xì)胞比例均高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。 見表2。

    表2 腫瘤局部DC細(xì)胞比例變化 (n=5,±s)

    表2 腫瘤局部DC細(xì)胞比例變化 (n=5,±s)

    注:a與術(shù)前比較 P < 0.05;b與對照組比較 P < 0.05

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    2.3 冷凍消融治療對腫瘤局部DC活化比例的影響

    與術(shù)前比較,治療組術(shù)后第1天腫瘤局部DC活化比例開始增多(P<0.01),于術(shù)后第7天達最高值(P < 0.01),之后隨時間延長,逐漸下降,至術(shù)后第21天恢復(fù)至術(shù)前水平(P>0.05)。對照組腫瘤局部DC活化比例無明顯改變,各時間點之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P > 0.05)。 術(shù)后 1、7、14 d 相同時間點腫瘤局部DC活化比例治療組均高于對照組,組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。 見表3。

    表3 治療后腫瘤局部DC活化比例變化 (n=5,±s)

    表3 治療后腫瘤局部DC活化比例變化 (n=5,±s)

    注:a與術(shù)前比較 P < 0.05;b與對照組比較 P < 0.05

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    治療組腫瘤局部HMGB1表達量與DC數(shù)量、活化比例均成高度正相關(guān)(r=0.883,r=0.997,P <0.05)。

    3 討論

    HMGB1廣泛分布于高等生物真核細(xì)胞核內(nèi),多種病理過程中組織細(xì)胞的壞死和損傷,均可使核內(nèi)的HMGB1游離并釋放至細(xì)胞外甚至血清中,作為細(xì)胞因子的HMGB1釋放到細(xì)胞外可產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)[3-4]。相關(guān)研究顯示HMGB1在多種腫瘤均呈高表達[1,5-7],氬氦冷凍消融治療作為一種物理消融治療方式能短時間內(nèi)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞壞死,在腫瘤細(xì)胞壞死的同時是否會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)HMGB1釋放至細(xì)胞外,以及HMGB1釋放至細(xì)胞外的量與時間的關(guān)系如何,國內(nèi)外尚少見相關(guān)文獻報道。

    本實驗結(jié)果顯示,對荷瘤小鼠實施冷凍消融治療后腫瘤局部組織中HMGB1明顯增高,并于術(shù)后第7天達最高值,之后隨著時間延長逐漸下降于術(shù)后第21天恢復(fù)至術(shù)前水平。以往實驗結(jié)果證實,HMGB1 在前列腺癌組織中高表達[1,7]。冷凍消融治療可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞大量壞死,而細(xì)胞壞死或損傷是HMGB1釋放的重要途徑之一[8],因此我們有理由相信腫瘤組織局部存在的大量HMGB1是由冷凍消融導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞壞死后釋放至細(xì)胞外。同時本實驗結(jié)果亦顯示在接受冷凍消融治療后,HMGB1于術(shù)后第7天達到最高值,分析其原因主要為:氬氦冷凍消融治療可使腫瘤組織快速冷至-160℃以下,可直接引起癌細(xì)胞脫水和破裂;同時也會破壞腫瘤小血管而致缺氧,進而導(dǎo)致更多的腫瘤細(xì)胞死亡[9],釋放更多的HMGB1。

    新近研究表明,作為免疫佐劑的HMGB1能夠加速炎性粒細(xì)胞向抗原侵入的地方移動,并能促進APC和DC活化,并且能加速他們到達淋巴結(jié)及促進靜止的T淋巴細(xì)胞活化,誘導(dǎo)細(xì)胞毒性因子釋放,間接影響其他免疫細(xì)胞[10-13]。有關(guān)壞死細(xì)胞反應(yīng)的成熟DC細(xì)胞中是否含有HMGB1的研究結(jié)果顯示,在壞死的海拉癌細(xì)胞株培養(yǎng)上清液中含有具有HMGB1的成熟的DC細(xì)胞,在上清液中加入HMGB1抗體能阻止DC成熟,缺乏HMGB1的上清液中壞死細(xì)胞誘導(dǎo)DC細(xì)胞成熟作用明顯減弱[14]。冷凍消融導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞壞死釋放的HMGB1對DC數(shù)量的變化及活化程度能夠產(chǎn)生何種影響,本研究將腫瘤局部組織中DC數(shù)量、DC活化比例與腫瘤組織局部HMGB1的表達水平行相關(guān)分析,結(jié)果顯示DC細(xì)胞數(shù)量及活化程度與腫瘤組織HMGB1表達水平呈高度正相關(guān)關(guān)系。說明冷凍消融治療后機體內(nèi)HMGB1介導(dǎo)了體內(nèi)DC數(shù)量、DC活化比例的增高。上述結(jié)果說明單純冷凍消融治療能夠通過HMGB1釋放刺激機體DC數(shù)量增加和活化程度提高,進而增強機體特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)。

    然而,HMGB1通過何種確切的機制實現(xiàn)對DC以及冷凍免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)有待深入研究。隨著對冷凍免疫反應(yīng)及其受體調(diào)控機制研究的深入及相關(guān)信號通路的逐漸闡明,將為冷凍免疫反應(yīng)研究開辟新途徑。

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