檸檬酸和溫度聯(lián)合處理對海水魚中副溶血性弧菌的殺滅作用

丁珊珊，楊振泉，李寶利，潘志明，焦新安

2.揚州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，揚州 225009

副溶血性弧菌（Vibrioparahaemolyticus，以下簡稱Vp）屬于弧菌科弧菌屬，是一種革蘭氏陰性嗜鹽細菌，主要分布在近海岸的海水、海河交界處和魚類、蝦類、貝類等海產(chǎn)品中。江蘇地區(qū)2008年和2009年食源性致病菌監(jiān)測研究數(shù)據(jù)顯示Vp檢出率分別為15.9%和7.8%，居于首位，生食水產(chǎn)品導(dǎo)致食源性疾病的風(fēng)險較高［1］。因此，控制在海產(chǎn)品中Vp的帶菌量，建立科學(xué)的減菌和殺菌方法至關(guān)重要。

目前對于Vp的控制手段主要有流水凈化、溫度處理、高壓處理、輻射等，但是這些方法都不能經(jīng)濟安全有效地抑制水產(chǎn)品中Vp［2］。有研究發(fā)現(xiàn)有機酸食品添加劑能有效抑制Vp，但是在抑制過程中食品的風(fēng)味發(fā)生了改變［3］。2000年，Andrews等人提出低溫巴氏殺菌（48℃～50℃，5 min）可使貝類中Vp（1.2×105MPN/g）降低到不能檢測水平（＜3MPN/g），但是這種處理可能會導(dǎo)致貝內(nèi)容物發(fā)生變化［4］。很少有研究報道有機酸和溫度聯(lián)合處理對于Vp的作用，為此，我們建立一種既能降低Vp帶菌量，又能最大限度地保證海產(chǎn)品鮮度的新型控制手段。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑Vp大流行株RIMD2210663由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院饋贈；Vp標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC33847和ATCC17802由上海疾病預(yù)防與控制中心饋贈；環(huán)境分離株Vp098、Vp343和Vp012由揚州大學(xué)江蘇省人獸共患病學(xué)重點實驗室分離鑒定并保存。

瓊脂培養(yǎng)基TCBS購自杭州微生物試劑有限公司。LBS液體培養(yǎng)基、高離子強度鹽溶液（0.1 mol/L KCl＋0.01mol/L NaCO3＋ 0.04 mol/L Na HCO3）、50 mmol/L CaCl2、4 M KCl均由本實驗室自制，其它試劑均為分析純。1.2 方法

1.2.1 菌懸液制備 挑取 RIMD2210663、ATCC33847、ATCC17802、Vp098、Vp343、Vp012的TCBS典型單菌落至LBS培養(yǎng)液，37℃，180 r/min，過夜振蕩培養(yǎng)。分別吸取10 μL過夜培養(yǎng)物至新鮮LBS培養(yǎng)液，37℃，180 r/min，振蕩培養(yǎng)4～5 h，測六種菌株的OD600值，并調(diào)OD600至0.8左右。均勻混合 RIMD2210663、ATCC33847、ATCC17802、Vp098、Vp343、Vp012這6種菌株，制成混合菌懸液備用。1.2.2Vp死亡率測定 用無菌微量移液器分別吸取處理前后菌液100μL，沿管壁緩緩注入含有900μL PBS的無菌1.5 m L離心管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖使其混合均勻，制成1∶100的樣品勻液。根據(jù)對樣品污染狀況的估計，按上述操作，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。選取2～3個適宜的連續(xù)稀釋度，每個稀釋度接種3個無菌TCBS平皿，每皿100μL。選取菌落數(shù)在20 CFU－300 CFU之間的平板，分別計數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑Vp菌落，典型菌落為墨綠色。

計算公式：

1.2.3單因素試驗 以死亡率為指標(biāo)，分別對p H、溫度、時間作單因素試驗。吸取100μL混合菌液于1.5 m L中，12 000 r/min離心8 min，重懸，在45℃、50℃、55℃、60℃、65℃水浴中處理，分別于5 s、25 s、45 s、65 s、85 s取樣分析細菌的死亡率。同樣分別吸取100μL混合菌液，離心沉淀，用PBS重懸，稀釋，涂板，37℃，培養(yǎng)24 h，計數(shù)得到處理前菌落數(shù)，其余分別用p H2.5、p H3.5、p H4、p H4.5、p H5的檸檬酸溶液重懸，在55℃水浴中處理15 s，稀釋，涂布，37℃，培養(yǎng)24 h，計數(shù)，計算死亡率。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化溫度、p H和時間 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box－Benhnken的中心組合實驗設(shè)計，以溫度、p H、時間3個因素為自變量，菌株死亡率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面分析法在三因素三水平上對處理條件進行優(yōu)化，以獲得最大死亡率。試驗因素與水平設(shè)計如表1所示。根據(jù)表1，Box－Benhnken軟件自動生成17種組合條件，如表2所示。例如第一種組合是吸取兩組混合菌懸液各100μL，一組直接離心、PBS重懸、稀釋涂板，37℃培養(yǎng)24 h，計數(shù)，獲得處理前菌落數(shù)，另一組混合于1 mL p H5.5檸檬酸溶液中，60℃水浴處理15 s，然后離心、PBS重懸，稀釋涂布，37℃培養(yǎng)24 h，計數(shù)，獲得處理后菌落數(shù)，以計算死亡率。其它16種組合根據(jù)具體條件做法同上。

1.2.5 最優(yōu)條件的驗證 根據(jù)17種組合的試驗數(shù)據(jù)，軟件自動分析得出最佳組合條件，對該條件進行驗證并考查該條件對魚蛋白活性的影響。

1.2.5.1 樣品處理 將市售新鮮三文魚肉冷凍狀態(tài)下切割成大小均一的塊狀，用滅菌生理鹽水浸泡洗滌9～10次，并檢測Vp的攜帶情況。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平Tab.1 Factors and their coding levels in response surface analysis

1.2.5.2 人工污染 取6塊魚肉樣品解凍后置于混合菌液中浸泡10～15 min，用鑷子取出分裝至玻璃瓶中（每瓶1片），其中3瓶做對照組，加PBS，攪勻，稀釋涂布于TCBS平板，37℃培養(yǎng)24 h后計數(shù)。其余3瓶做處理組，加p H4.96檸檬酸溶液，在55.5℃條件下處理25 s后，攪勻，稀釋涂布于TCBS平板，37℃培養(yǎng)24 h后計數(shù)。

1.2.6 魚蛋白活性的測定

1.2.6.1 肌原纖維蛋白的制備 為了進一步觀察處理條件對魚蛋白活性的影響，參考李來好等［5］的報道取三文魚肉2 g各兩份，一份做對照組，一份用p H4.96，55.5℃，25 s處理，兩組分別放在研缽中并置于冰箱急凍室冷凍5～10 min，取出研碎，在凍水浴中邊研磨邊加入20 m L預(yù)冷的高離子強度鹽溶液，研磨15 min。然后加10倍冰水稀釋，攪勻放在4 000 r/min的離心機中離心10 min，棄去上清液，取出沉淀物。再同法洗滌離心3次，最后得到的肌原纖維沉淀物加Tris－HCl緩沖液（p H7.0）勻漿攪勻，然后定容至100 m L，所得的肌原纖維懸濁液供Ca2＋－ATPase活性測定。

1.2.6.2 Ca2＋－ATPase 活性的測定 在試管中加入 20 mmol/L Tris－HCl 2.5 mL、50 mmol/L CaCl21.0 mL、4 M KCl 1.0 m L、6.67 mmol/L d ATP 1.5 m L和4.0 m L肌原纖維蛋白酶液，最后加入1.0 m L15%的三氯醋酸終止反應(yīng)。用鉬酸銨法在314 nm波長測定磷含量。

2 結(jié) 果

2.1 單因素試驗結(jié)果 在45℃、50℃、55℃、60℃、65℃溫度條件下分析了溫度對Vp死亡率的影響（圖1a），死亡率隨溫度的升高而增大，45℃至50℃死亡率上升最迅速，上升了近13%，55℃至60℃上升較迅速，上升了近5%，當(dāng)溫度大于60℃時，死亡率已接近100%，變化不顯著。結(jié)合實際生產(chǎn)應(yīng)用情況，適宜的溫度范圍確定為50℃～60℃。

在p H2.5、p H3.5、p H4、p H4.5、p H5.5條件下分析了p H對Vp死亡率的影響（圖1b），Vp死亡率隨p H的增大而降低。Vp在p H2.5的檸檬酸溶液中死亡率近100%，當(dāng)p H至5.5時死亡率降低了近5%，這說明Vp有一定的耐酸能力?？紤]到食品風(fēng)味的需求，適宜的p H范圍確定為4.5～5.5。

圖1 單因素試驗注：圖1（a）、圖1（b）、圖1（c）分別為溫度、p H、時間作為單因素對Vp 死亡率的影響。Fig.1 Single factor experimentNote：（a），（b），and（c）show the effects of single factor temperature，p H and time，respectively，on the death of Vp.

在不同作用時間分析了時間對Vp死亡率的影響對Vp死亡率的影響（圖1c），曲線呈S型，在起始25 s內(nèi)，死亡率僅增加了1%，在25 s至45 s，死亡率增加了近4%，65 s后死亡率接近100%。為了保證食品鮮度，盡可能選擇較短作用時間，故選擇5 s－25 s。

2.2 響應(yīng)面分析法對控制條件的優(yōu)化

2.2.1 模型建立及顯著性檢驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以溫度（A）、時間（B）、p H（C）為自變量，以死亡率（y）為響應(yīng)值，分析方案及實驗結(jié)果見表2。

二次多項回歸模型方程為：

對該模型進行方差分析，結(jié)果見表3，模型系數(shù)顯著性檢驗見表4。由表3可以看出P＜0.000 1，說明模型方程不同處理間的差異顯著；失擬項P＝0.1262＞0.05，不顯著；模型的校正決定系數(shù)R2Adj＝96.73%，說明該模型能解釋約96.73%響應(yīng)值的變化，僅有總變異3.27%不能用此模型解釋，相關(guān)系數(shù)R＝99.28%，說明該模型擬合程度良好。表4回歸方程系數(shù)顯著性檢驗可知：模型一次項A（P＜0.05）、C（P＜0.05）顯著；二次項 A2、C2顯著；交互項不顯著。

表2 響應(yīng)面分析方案及實驗結(jié)果Tab.2 Experimental design and results for response surface analysis

表3 回歸模型方差分析Tab.3 Variance analysis of regression equation

2.2.2 響應(yīng)曲面分析及優(yōu)化 由上述結(jié)果得出，T和p H是對Vp死亡率影響最大的因素，其中以p H尤為重要?？梢钥闯?，隨著溫度的升高和p H的降低，死亡率也逐漸升高。當(dāng)溫度和p H分別在53.5℃～60℃和4.75～5.25的范圍內(nèi)時，死亡率最大。響應(yīng)面軟件給出的最優(yōu)組合是：55.5℃、25 s、p H4.96，模型預(yù)測死亡率為97.36%。

2.3 最優(yōu)條件的驗證

2.3.1Vp死亡率 人工污染三文魚，根據(jù)下面三組條件處理，比較死亡率。從上圖3可以看出，70℃，25 s處理后死亡率達到76.09%，p H4.6，5 s處理后死亡率達到94.1%，而55.5℃，25 s與p H4.96聯(lián)合處理后死亡率達到97.07%，這說明p H和溫度的聯(lián)合作用優(yōu)于它們單獨處理效果。

表4 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗表Tab.4 Significance test for regression coefficients

圖2 Vp的死亡率與個兩因素的函數(shù)關(guān)系圖和等高線圖Fig.2 Response surface and contour plots for the effect of cross－interaction among two factors on death rate of Vibrio parahaemolyticus

圖3 在三文魚上驗證Vp死亡率Fig.3 Death rate of Vp on salmon

2.3.2 魚蛋白活性 Ca2＋－ATPase活性單位，是在一定的條件下，以每分鐘每毫克肌原纖維蛋白酶分解ATP所釋放的磷酸根中磷微克分子量來計算（μmol Pi/min.mg pro.）。圖4顯示，與對照組相比，55.5 ℃、p H4.96、25 s處理后 Ca2＋－ATPase活性差異不顯著，而p H2，25 s和80℃，25 s處理后，Ca2＋－ATPase活性顯著降低。這說明55.5 ℃、p H4.96、25 s的處理條件從某種程度上可以保證魚蛋白的活性。

圖4 魚蛋白活性的測定結(jié)果Fig.4 Ca2＋ －ATPase activity of salmon

3 討 論

作為某些天然成分的有機酸對人類無害，被列為食品添加劑。因為有機酸的抗菌效應(yīng)，它還被應(yīng)用于控制飼料原料和飼料保存中細菌的生長［6］。有機酸通過兩種途徑作用于微生物，一是p H的影響，二是其陰離子還具有獨特的殺菌功能［7］。對于引起胃腸疾病的病原菌，Russell等人認(rèn)為，有機酸的殺菌作用主要是由其陰離子引起的。無機酸作用不佳，可能在于不具有有機酸陰離子的類似作用［8］。有機酸的抗菌效果隨著有機酸碳鏈的增長和不飽和度的增加而增強［9］。有人研究報道檸檬酸飲料對弧菌有強烈的抑制作用［10］。

目前，水產(chǎn)品鮮度的評價方法主要包括感官評價、微生物檢驗、化學(xué)檢驗、物理指標(biāo)評價和鮮度指示蛋白評價等［11］?；诒狙芯康哪康氖且疾鞙囟群退嵝原h(huán)境對魚鮮度的影響，我們借鑒李來好［5］等人的關(guān)于鯔魚蛋白質(zhì)變性研究，選擇魚蛋白Ca2＋－ATPase活性作為指標(biāo)。魚的肌動蛋白和肌動球蛋白切斷ATP末端的磷酸基團產(chǎn)生ADP和Pi。通過比色測定，測定無機磷含量，可以表明ATPase活性。無機磷含量的測定采用釩鉬酸銨法。

我們研究發(fā)現(xiàn)，70℃處理25 s時，Vp死亡率達到76.09%（降低了0.59－0.67個數(shù)量級），而55.5℃、p H4.96處理25 s，Vp死亡率達到97.73%（降低了1.34－1.92個數(shù)量級）。Castillo等人報道使用單獨蒸汽滅菌效果明顯不及乳酸和溫度聯(lián)合的蒸汽滅菌效果［12］。又有人研究也發(fā)現(xiàn)單獨用p H 2.40乳酸處理15 s后腸炎沙門菌降低了0.70個數(shù)量級，但是當(dāng)用p H 2.40乳酸、82℃、15 s處理后，降低了0.86～1.19個數(shù)量級［13］。Ikeda等人研究報道被單核細胞增生性李斯特菌人工污染的牛肉經(jīng)過75℃，30 s處理和p H 2.40、55℃、30 s處理后，菌落數(shù)分別降低了1.4～2和1.8～2.6個數(shù)量級［14］。盡管這些研究條件有差異，但是它們和本研究一起證實了有機酸處理使較低溫殺菌成為可能。而且本研究還進一步驗證了建立的條件對魚蛋白活性影響不顯著。但是在實際應(yīng)用中，魚肉的大小和厚度會不會影響滅菌效果，而且Pohlman等人指出當(dāng)使用多種抑菌處理手段時，處理的順序是很重要的［15］。這需要后續(xù)試驗完善。目前有研究報道3%NaCl相比于2%和1%NaCl使VpO3：K6對p H和溫度環(huán)境的壓力有很好的耐受力［16］，說明鹽度與Vp的耐酸機制有關(guān)。那么本研究中那些經(jīng)過處理后近3%存活的Vp，是否也有什么保護機制存在，還不清楚，有待進一步探討。

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