空氣凈化器降低室內(nèi)塵螨過敏原含量及其免疫反應(yīng)性的實(shí)驗(yàn)研究

馬忠校，劉曉宇，楊小猛，王媛媛，吳瑩瑩，劉志剛

過敏性疾?。ㄗ儜B(tài)反應(yīng)性疾?。┍皇澜缧l(wèi)生組織（WHO）列為21世紀(jì)重點(diǎn)防治的三大疾病之一，是當(dāng)前世界性的重大衛(wèi)生學(xué)問題，世界各國(guó)變態(tài)反應(yīng)性疾病的總發(fā)病率高達(dá)15%～30%，近20年來發(fā)病率幾乎翻了一倍。據(jù)統(tǒng)計(jì)，歐盟每年用于過敏性疾病治療的費(fèi)用達(dá)百億歐元；在美國(guó)全年用于過敏性疾病的治療費(fèi)用超過了AIDS和肺結(jié)核治療費(fèi)用的總和，目前我國(guó)過敏性疾病患者達(dá)2～3億人［1－3］，故過敏性疾病不僅嚴(yán)重危害個(gè)人健康，而且給個(gè)人、家庭和社會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

因此，防螨措施中，除了控制室內(nèi)物體表面的塵螨外，更重要的是降低室內(nèi)空氣中過敏原的含量。而空氣凈化器恰好為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)提供了可能。本實(shí)驗(yàn)所研制的空氣凈化器是一款裝有高效消毒過濾系統(tǒng)（disinfecting filtration system，DFS）的空氣凈化器。該空氣凈化器主要運(yùn)用的是等離子殺菌和靜電場(chǎng)加強(qiáng)除塵原理，來殺滅和吸附空氣中的細(xì)菌和病原微生物，達(dá)到凈化居室空氣環(huán)境的目的。但本實(shí)驗(yàn)采用的空氣凈化器對(duì)降低室內(nèi)空氣中塵螨抗原的濃度以及塵螨過敏原免疫反應(yīng)性的變化，國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 調(diào)查點(diǎn)選擇 選擇20個(gè)臥室裝有空調(diào)并1個(gè)月以上未清洗過空氣防塵濾網(wǎng)的家庭和學(xué)生宿舍進(jìn)行采樣，且被采集家庭均無哮喘等過敏性疾病患者。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料和主要試劑與儀器 粉塵螨由深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院過敏反應(yīng)與免疫學(xué)研究室提供，于恒濕（相對(duì)濕度75%±1%）、恒溫（27±0.5℃）培養(yǎng)室中隔離培養(yǎng)。47 mm玻纖膜（美國(guó)PALL公司），BCF－300微電腦粉塵采樣器（江蘇省金壇市億通電子有限公司），Der f1、Der f2雙抗體夾心ELISA試劑盒（英國(guó)Indoor Biotechologies公司），Tween－20（美國(guó)Sigma公司），其他為分析純?cè)噭?/p>

1.3 樣品的采集 2011年7－9月，分別在深圳大學(xué)教工家屬區(qū)和學(xué)生宿舍臥室中央安裝粉塵采樣器，距離地面約有1.5 m高，粉塵采樣器的空氣流量20 L/min。實(shí)驗(yàn)采樣分為以下4組：（1）不開空調(diào)和空氣凈化器；（2）開空調(diào)、不開空氣凈化器；（3）同時(shí)開空調(diào)和空氣凈化器；（4）開空氣凈化器、不開空調(diào)。采樣前粉塵采樣器上裝有玻璃纖維膜（孔徑為0.3 μm），用來阻留空氣中的灰塵微粒。分別采樣8 h，兩次采樣間隔24 h以上，采集時(shí)間和方法同上。

1.4 樣品的處理和提取 每次采樣結(jié)束后，分別收集采樣器上的玻璃纖維膜，用剪刀將其剪碎，置于5～10 mL的注射器內(nèi)，加入1 mL（含1%小牛血清蛋白和0.05%Tween－20）磷酸鹽緩沖液（PBST），4℃提取過夜，期間振搖。用注射器將玻纖膜中的提取液充分?jǐn)D壓出來，再將提取液4℃3 000×g離心30 min，取上清。同時(shí)收集經(jīng)空氣凈化器作用24 h、48 h和72 h時(shí)間死亡的粉塵螨（各組200只），在微型玻璃均漿器中，加1 m L PBST進(jìn)行均漿，離心后取上清，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 空氣中塵螨過敏原含量的測(cè)定 把每份玻纖膜提取液用PBST－BSA（1%）作1∶2稀釋，按照ELISA試劑盒說明書測(cè)定主要過敏原Der f1和Der f2的濃度，主要步驟：分別包被Der f1和Der f2單克隆抗體，4℃過夜，2%小牛血清蛋白封閉過夜，加入待測(cè)樣品，每孔100μL，室溫1 h，洗滌后分別對(duì)應(yīng)加入生物素標(biāo)記的抗Der f1和Der f2單抗，室溫1 h，再加入HRP標(biāo)記的鏈霉親和素。四甲基聯(lián)苯胺（TMB）底物顯色，測(cè)吸光度（A450值）。以A450值為縱坐標(biāo)，以蛋白濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測(cè)標(biāo)本Der f1和Der f2含量。

1.6 粉塵螨主要過敏原的測(cè)定 將上述各組粉塵螨提取液用PBST－0.1%BSA作1∶10對(duì)比稀釋，用ELISA測(cè)定粉塵螨Der f1和Der f2的濃度，方法同上。

1.7 過敏患者血清和免疫組化 臨床收集過敏性疾病塵螨陽性患者血清（Unit－CAP 3級(jí)以上）20例，－20℃保存。實(shí)驗(yàn)用粉塵螨（活螨）和24 h、48 h和72 h組死亡粉塵螨，固定、包埋和切片，先經(jīng)3%過氧化氫孵育60 min，滅活內(nèi)源性酶，然后經(jīng)PBS清洗，微波煮沸修復(fù)抗原，冷卻，再加入正常羊血清封閉液室溫下作用20 min，去多余液體，不洗。加入PBS稀釋（1∶8）的塵螨過敏患者陽性血清，37℃下作用60 min，再加入生物素標(biāo)記的羊抗人Ig E抗體（效價(jià)1∶500）室溫下作用60 min，SABC復(fù)合物（PBS1∶100稀釋）室溫下作用60 min，經(jīng)二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，二甲苯透明、封片。陰性對(duì)照用健康人血清。圖像采集在顯微鏡下（Olympus Bx－51），由Olympus DP70數(shù)碼相機(jī)拍攝（日本O lympus公司）完成。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS11.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用 MATLAB數(shù)學(xué)分析軟件制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，空氣中塵螨主要過敏原濃度的比較采用兩樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 室內(nèi)空氣中塵螨過敏原濃度的測(cè)定 采用ELISA方法檢測(cè)采集的空氣樣品，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1和圖1、2所示，A，B，C，D代表4種采樣方式，分別是：A代表自然狀態(tài)下采樣；B代表開啟空調(diào)的情況下采樣；C代表空調(diào)和空氣凈化器同時(shí)開啟的情況下采樣；D代表只開啟空氣凈化器的情況下采樣。檢測(cè)結(jié)果顯示，在打開空調(diào)的情況下室內(nèi)的過敏原Der f1（圖1）和Der f2（圖2）濃度都增加，與開空調(diào)前相比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。當(dāng)使用空氣凈化器后，室內(nèi)空氣中過敏原Der f1和Der f2濃度則明顯減少，空氣凈化器使用前后室內(nèi)空氣過敏原濃度差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表1 4種采樣方式下室內(nèi)空氣中塵螨過敏原的含量Tab.1 Indoor mite allergen levels from different sampling environment

2.2 空氣凈化器作用前后粉塵螨過敏原活性的測(cè)定 分別將活螨和放在空氣凈化器中作用不同時(shí)間（24 h、48 h，72 h）后死亡的粉塵螨各挑取200只，另PBST均漿，提取粉塵螨過敏原，用ELISA進(jìn)行檢測(cè)，第0 h組（活螨）與第24 h、48 h、72 h（死亡粉塵螨）有顯著性差異（P＜0.01），而24 h、48 h，72 h組之間無顯著性差異（P＞0.05），提示粉塵螨經(jīng)空氣凈化器等離子和靜電高壓場(chǎng)強(qiáng)殺滅后，其免疫反應(yīng)性較活螨顯著降低，而不同時(shí)間死亡粉塵螨的抗原免疫反應(yīng)性無明顯變化。

圖1 空氣凈化器開機(jī)前后室內(nèi)空氣中塵螨過敏原Der f1含量Fig.1 Der f 1 concentarion before and after air cleaner operatingA：Sampling in natural environment；B：Sampling under air condition operating；C：Sampling under air cleaner and air condition operating togerher；D：Sampling under air cleaner operating

圖2 空氣凈化器開機(jī)前后室內(nèi)空氣中塵螨過敏原Der f2含量Fig.2 Indoor Der f 2 concentarion before and after air cleaner operatingA：Sampling in natural environment；B：Sampling under air condition operating；C：Sampling under air cleaner and air condition operating togerher；D：Sampling under air cleaner operating

表2 作用不同時(shí)間后粉塵螨過敏原的免疫反應(yīng)性Tab.2 Immunoreactivity of dust mite allergen after different reaction time

2.3 粉塵螨免疫組化抗原定位及免疫反應(yīng)性觀察

將活螨和放入空氣凈化器中分別處理24 h，48 h，72 h之后死亡的粉塵螨，石蠟包埋，切片，然后選取各個(gè)時(shí)間組粉塵螨的縱切面，用塵螨過敏病人的血清為一抗，以抗人IgE為二抗，運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法，定位粉塵螨主要過敏原。正常粉塵螨抗原存在于螨體內(nèi)多個(gè)部位，主要包括口咽部、中腸、腸內(nèi)容物以及生殖腺等處，見圖3。

死亡粉塵螨體內(nèi)過敏原主要集中于腸腔中，其他部位較少。經(jīng)空氣凈化器等離子和靜電高壓場(chǎng)強(qiáng)作用死亡后粉塵螨抗原免疫反應(yīng)性顯著減弱，且各處理時(shí)間段過敏原定位差異不大，見圖4。

圖3 正常粉塵螨抗原定位結(jié)果Fig.3 Antigen location in living mite

圖4 不同作用時(shí)間粉塵螨死亡后蟲體抗原定位結(jié)果A：24 h；B：48 h；C：72 hFig.4 Antigen location in dead mite treated for serial timesA：24 h；B：48 h；C：72 h

3 討 論

塵螨是一種體形微小的節(jié)肢動(dòng)物，其廣泛分布于人類的居室和工作環(huán)境中，在與人體接觸密切的床單、被褥、枕墊、衣服、沙發(fā)套和地毯等處生存繁殖，誘發(fā)過敏性疾?。ㄈ缦?、過敏性鼻炎等）［4］。過敏性疾病主要是指IgE介導(dǎo)的I型變態(tài)反應(yīng)。過敏性疾病的發(fā)病原因錯(cuò)綜復(fù)雜，主要涉及兩個(gè)方面：1、具備易發(fā)生變態(tài)反應(yīng)的特應(yīng)性體質(zhì)；2、環(huán)境因素，而環(huán)境因素中過敏原是最主要的誘因。目前，“預(yù)防策略”已經(jīng)成為過敏性疾病防治的重要內(nèi)容［5］。

過敏性疾病的預(yù)防可分為初級(jí)、二級(jí)和三級(jí)預(yù)防，初級(jí)預(yù)防又稱病因（發(fā)病前期）預(yù)防，是最積極的預(yù)防措施［6］。它是指采取各種措施來控制或消除影響健康的危險(xiǎn)因素，使健康人免受致病因素侵害，防患于未然。WAO 2004年制定了《過敏反應(yīng)和過敏性哮喘預(yù)防指南》，在初級(jí)預(yù)防中明確提出清除工作環(huán)境中的致敏原和強(qiáng)刺激物，而本實(shí)驗(yàn)研制的除螨空氣凈化器，具有顯著的殺螨作用（另文報(bào)道），同時(shí)，還具有降低室內(nèi)空氣中塵螨主要過敏原的濃度。研究表明，降低室內(nèi)塵螨數(shù)量和空氣中塵螨抗原濃度，或減少與塵螨的接觸時(shí)間，可以大大緩解過敏患者的癥狀，降低塵螨導(dǎo)致的過敏性疾病的發(fā)病率［7］。如何降低室內(nèi)環(huán)境中塵螨過敏原的數(shù)量、避免與塵螨接觸而引起的過敏性疾病就顯得尤其重要。

目前的防螨措施主要是針對(duì)室內(nèi)家具或者床上用品表面灰塵中的塵螨及其過敏原。如針對(duì)枕頭、床墊的防螨套被大量的應(yīng)用，但是人們發(fā)現(xiàn)雖然防螨套能夠明顯降低灰塵中螨數(shù)量和螨過敏原，卻在減輕過敏患者癥狀和室內(nèi)空氣中塵螨抗原含量方面效果不一。Zhigang Liu等國(guó)際上首次報(bào)道室內(nèi)空調(diào)濾網(wǎng)灰塵中可孳生大量塵螨，在夏季70%～80%家庭空調(diào)灰塵中有塵螨的孳生、最高達(dá)到2 000多只螨/克灰塵，并證實(shí)通過空調(diào)送風(fēng)可使室內(nèi)空氣中塵螨抗原含量升高，空調(diào)送風(fēng)是導(dǎo)致室內(nèi)塵螨抗原含量升高的一種重要傳播方式［8］。因此，防螨措施中，除了控制室內(nèi)物體表面的塵螨及其過敏原外，更主要的是降低室內(nèi)空氣中過敏原的含量。

國(guó)內(nèi)外研究資料表明近年城市居民每天約70%～90%的時(shí)間在各種室內(nèi)環(huán)境中度過［9］。WHO研究表明：當(dāng)室內(nèi)環(huán)境空氣中塵螨抗原含量達(dá)2μg/m L可致敏，當(dāng)抗原含量＞10μg/m L時(shí)可導(dǎo)致哮喘的發(fā)作。因此，除螨（防螨）和降低室內(nèi)空氣中塵螨抗原的含量對(duì)預(yù)防和干預(yù)（哮喘等）過敏性疾病至關(guān)重要。

本實(shí)驗(yàn)研制空氣凈化器中的等離子是一種指高度電離的氣體云［10］，等離子的成分包括自由電子、離子、激發(fā)態(tài)分子原、基態(tài)分子原和電磁輻射等，是空氣中的水氧氣等物質(zhì)在高壓電磁場(chǎng)作用下生成的［11－12］。塵螨作為一種低等節(jié)肢動(dòng)物，僅靠基節(jié)腺調(diào)節(jié)體內(nèi)水份，對(duì)環(huán)境中濕度極為敏感，故當(dāng)空氣凈化器將空氣中的大量水分電離成為離子狀態(tài)時(shí)，造成局部相對(duì)干燥的環(huán)境［13］，再加上靜電高壓場(chǎng)強(qiáng)的共同作用，而使粉塵螨脫水死亡。故本課題研制的空氣凈化器可降低室內(nèi)空氣中塵螨抗原含量、可預(yù)防和干預(yù)哮喘的發(fā)作，從源頭上阻斷過敏性疾病的發(fā)生具有重要意義。

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