4種ELISA方法檢測?？谔阋叻墙Y(jié)構(gòu)蛋白抗體的ROC評價

王 歡，張潤祥，李 迪，曹永生，高明春，王君偉

口蹄疫（Foot and mouth disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒（Foot and mouth disease，F(xiàn)MDV）引起的急性，高度接觸性傳染病，主要感染偶蹄家畜，給畜牧業(yè)的發(fā)展帶來嚴重威脅。FMDV是小RNA病毒科口蹄疫病毒屬成員，有7種血清型，分別為O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3以及 Asia1型，型間無交叉免疫保護［1］。

由于ELISA的檢測抗原、操作形式等各有不同，因此其敏感性和特異性存在一定差異，實際應用中需要對這些方法進行客觀的比較評價，國外對NSP－ELISA 的評估進行了多篇報道［2－4］，泛美口蹄疫中心（PANAFTOSA）和英國Pirbright實驗室分別制作了評價各種方法的牛源血清盤，而國內(nèi)尚無對?？谔阋逳SP－ELISA的評價報告。

ROC曲線（receiver operating characteristic curve）分析被認為是一種試驗評價中的理想和經(jīng)典方法［5］，是將檢測結(jié)果劃分為若干臨界點，以每個臨界點對應的敏感性為縱坐標，“1－特異性”為橫坐標，作圖得到的曲線，可以比較直觀的看出敏感性與特異性之間的關(guān)系，通過計算ROC曲線下面積（Area Under the ROC，AUC）來評價診斷方法的準確性，是一種全而、準確評價診斷試驗的有效工具［11］。本研究以世界公認的商品化試劑盒Ceditest?ELISA為參考標準，對國內(nèi)3種商品化ELISA試劑盒和實驗室建立的8BF－ELISA方法［6］運用ROC曲線對4種ELISA方法進行綜合性評價。

1 材料與方法

1.1 試驗血清 用Ceditest?ELISA作為檢測標準，批號：07K570，164份血清來源于2個已知感染過FMD的且痊愈的牛場，其中85份陽性，79份陰性。

1.2 4種ELISA試劑盒 口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體檢測ELISA試劑盒，（以下簡稱ELISA A）由中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn)，批號：2008022608；口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白抗體單抗阻斷ELISA試劑盒，（以下簡稱ELISA B）由北京世紀元亨動物防疫技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號：CB2008031201；3B合成肽ELISA試劑盒，（以下簡稱ELISA C）由上海優(yōu)耐特生物醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)，批號；200806023；由本實驗室建立的8BF－ELISA方法，（以下簡稱ELISA D）［13］。

1.3 結(jié)果判定 ELISA A臨界值＝（OD樣品－OD陰性）/（OD陽性－OD陰性），其臨界值小于0.2，為陰性；大于0.3為陽性；在0.2－0.3之間為可疑，可疑樣品進行復測如果大于0.2為陽性；ELISA B臨界值＝（陰性對照孔OD均值－樣品孔OD均值）/陰性對照孔OD均值＊100%

被檢樣品阻斷率（Inh%）大于等于40%為抗體陽性；在25%－40%之間為可疑；小于25%為陰性；ELISA C臨界值＝0.23＊陽性對照孔平均OD值；ELSIA D臨界值判定同ELISA A。

1.4 統(tǒng)計學處理 用EXCEL2007和PASW/SPSS Statistics18聯(lián)合進行統(tǒng)計分析，通過對ROC曲線下面積（AUC）大小和Youden指數(shù)［7］分析，來確定ELISA檢測方法陽性判定結(jié)果的準確性和最適臨界值，評價4種ELISA檢測方法的檢測能力。

2 結(jié) 果

2.1 4種ELISA檢測方法對試驗樣本的檢測結(jié)果4種ELISA方法的檢測結(jié)果見表1，因為ELISA A B D均設有可疑區(qū)間，進行復測后把ELISA－A和D的臨界值設為0.2，ELISA B設為0.25，4種ELISA 方 法 的 檢 出 率 （Ef）分 別 為95.12%，89.02%，84.76%，93.29%。經(jīng)X2檢驗，ELISA C的檢出率低于其他3種檢測方法，且差異有統(tǒng)計學意義（P＝0.006＜0.01），其他3種ELISA方法的檢出率之間差異無統(tǒng)計學意義（P＝0.099＞0.05）。

表1 4種ELISA方法對確定血清FMDV－NSP抗體的檢測結(jié)果Tab.1 Four ELISA methods for determination of serum FMDV－NSP antibody test results

4種ELISA檢測方法的敏感性分別為96.47%（82/85），95.29% （81/85），70.59% （60/85），92.94%（79/85）；特異性分別為93.67%（74/79），82.28%（65/79），100.00%（79/79），93.67%（74/79）。

2.2 應用ROC曲線分析 見圖1，曲線起始部分上升較陡，表明試驗分辨率較精確；并且4種ELISA的ROC曲線均在參考線以上，并遠離標準線，且?guī)追N方法相應的ROC曲線非常接近。曲線下的面積見表2，根據(jù)Swets［8］判斷規(guī)則，面積越大，判斷越有效；面積越小，判斷價值越低。其中面積在0.5以下者試驗沒有診斷價值，面積在0.5～0.7之間有較低的準確性，面積在0.7～0.9之間有一定的準確性，在0.9以上者，則有較高的準確性ROC面積在0.937～0.982之間，表明4種方法都有很高的準確性。比較4種ELISA方法的ROC曲，線下面積（AUC），差異均不顯著。

2.3 確定最佳臨界值 以圖1的ROC曲線上的各切點作為閾值，計算相應的敏感性、特異性及Youden指數(shù)。Youden指數(shù)是分析敏感性和特異性的綜合評價指標，可以避免對于敏感性和特異性的偏移，能較客觀的反映實際情況。從圖2中可明顯看出Youden指數(shù)和試驗檢出率呈正相關(guān)的關(guān)系，并且在某一臨界值附近有相同的波峰，說明在這一臨界值附近有著很好的檢測能力。

圖1 4種ELISA方法對FMDV－NS抗體檢測結(jié)果的ROC曲線Fig.1 ROC curves of the four ELISAs for detection of FMDV－NSP antibodies

表2 曲線下的面積Tab.2 Area under the curve

圖2 在不同臨界值下，試驗檢出率與Youden指數(shù)的變化情況Fig.2 Detection rates and Youden index changes in the different threshold

圖2中的Youden指數(shù)，對應的切點為ROC曲線上的最佳臨界值，表3給出了四種ELISA方法在最佳臨界值時的敏感性、特異性和檢出準確率的比較。從表3能明顯看出在ROC曲線下應用最佳臨界值來檢測FMDV－NSP抗體要比使用制造商推薦的臨界值時的檢測準確率要高，且4種方法的準確率之間無顯著性差異（P＝0.461＞0.05）。

表3 四種ELISA在最佳臨界值時的敏感性、特異性和準確性Tab.3 Sensitivity，specificity and accuracy of the four ELISAs based on the optimization of the cut－off

3 討 論

2006年－2008年6個國家科學家通過對已知陰陽性血清檢測［9］，通過和3種商品化試劑盒，國際動物衛(wèi)生組織（OIE）參考方法（NCPanaftosascreening）及意大利室內(nèi)質(zhì)控方法（3ABC trapping－ELISA）進行ROC曲線和極大似然值法［17］，貝葉斯定律［10－11］等方法的全面比較分析評價：在商品化試劑盒中，Ceditest?ELISA的敏感性和特異性最優(yōu)，檢測結(jié)果接近OIE參考方法。因此本研究選擇了Ceditest?ELISA作為試驗的“金標準”，對國內(nèi)幾種NSP－ELISA進行了比較評價。表1可看出，ELISA C的相對特異性為100%，但敏感性只有70%，而ELISA A敏感性和特異性都超過了90%，但在臨界值＞＝0.3時特異性為98.7%，敏感性為89.2%；ELISA B在抑制率為40%時，敏感性和特異性分別77.6%和98.7%；ELISA D在臨界值為0.3時特異性和敏感性分別為97.4%和83.5%。但經(jīng)過ROC分析，用Youden指數(shù)結(jié)合敏感性和特異性給出另一臨界值時，4種檢測方法的敏感性和特異性趨于平衡，檢測準確率都有所增加。4種方法有3種都設有可疑區(qū)間，可以通過對可疑區(qū)間的復測來增加檢驗準確率，所以，在ELISA方法的建立過程中確保一定的可疑區(qū)間是比較科學的。

用ROC分析ELISA方法的檢測能力，國內(nèi)在獸醫(yī)研究方面的文獻相對較少。在本研究中，ROC分析ELISA A給出最大的AUC（見表2），要比其他3種方法稍微高一點，但其他三種方法的AUC也都超過了0.9，表明其他3種ELISA方法檢測能力也是比較好的，只是ELISA C的檢測敏感性略低，不太適合做大規(guī)模臨床樣本的檢測，但特異性較高可作為臨床樣本的確診試驗。綜合評估，在優(yōu)化臨界值后的ELISA A，ELISA B和ELISA D的敏感性和特異性都大于90%，均可用于大規(guī)模臨床樣本的初篩試驗。

［1］Alexandersen S，Zhang Z，Donaldson AI，et al.The pathogenesis and diagnosis of foot－and－mouth disease［J］.J Comp Pathol，2003，129（1）：1－36.DOI：10.1016/S0021－9975（03）00041－0

［2］Moonen P，van der Linde E，Chenard G，et al.Comparable sensitivity and specificity in three commercially available ELISAs to differentiate between cattle infected with or vaccinated against foot－and－mouth disease virus［J］.Vet Microbiol，2004，99（2）：93－101.DOI：10.1016/j.vetmic2003.12.003

［3］Bronsvoort BM，Sorensen KJ，Anderson J，et al.Comparison of two 3ABC enzyme－linked immunosorbent assays for diagnosis of multiple－serotype foot－and－mouth disease in a cattle population in an area of endemicity［J］.J Clin Microbiol，2004，42（5）：2108－2114.DOI：10.1128/JCM.42.5.2108－2114.2004

［4］Dekker A，Sammin D，Greiner M，et al.Use of continuous results to compare ELISAs for the detection of antibodies to nonstructural proteins of foot－and－mouth disease virus［J］.Vaccine，2008，26（22）：2723－2732.DOI：10.1016/j.vaccine.2008.03052

［5］Copas JB.Overestimation of the receiver operating characteristic curve for logistic regression［J］.Biometrika，2002，89（2）：315－331.DOI：10.1093/biomet/89.2.315

［6］Cheng W，Ni Z，Pan X，et al.Receiver operating characteristic curves to optimal operating point and doubtable value interval［J］.Mod Prev Med，2005（7）：729－731.（in Chinese）

陳衛(wèi)中，倪宗瓚，潘曉平，等.用ROC曲線確定最佳臨界點和可疑值范圍［J］.現(xiàn)代預防醫(yī)學，2005（7）：729－731.

［7］Gao M，Zhang R，Li M，et al.An ELISA based on the repeated foot－and－mouth disease virus 3B epitope peptide can distinguish infected and vaccinated cattle［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2012，93（3）：1271－1279.DOI：10.1007/s00253－011－3815－0

［8］Chen P，Wang B，Mo Y.Comparison of several statistical inference methods for diagnostic test［J］.Chin J Health Stat，1995（5）：8－11.（in Chinese）

陳平雁，王斌會，莫一心.幾種診斷試驗統(tǒng)計方法的比較［J］.中國衛(wèi)生統(tǒng)計，1995（5）：8－11.

［9］Swets JA.Measuring the accuracy of diagnostic systems［J］.Science，1988，240（4857）：1285－1293.DOI：10.1126/science.3287615

［10］Brocchi E，Bergmann IE，Dekker A，et al.Comparative evaluation of six ELISAs for the detection of antibodies to the nonstructural proteins of foot－and－mouth disease virus［J］.Vaccine，2006，24（47－48）：6966－6979.DOI：10.1016/j.vaccine.2006.04.050

［11］Goris N，Praet N，Sammin D，et al.Foot－and－mouth disease non－structural protein serology in cattle：use of a Bayesian framework to estimate diagnostic sensitivity and specificity of six ELISA tests and true prevalence in the field［J］.Vaccine，2007，25（41）：7177－7196.DOI：10.1016/j.vaccine.2007.07.023