BACTEC MIGT960在結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗(yàn)中的臨床研究

陳忠南，趙麗麗，易松林，譚 笑，胡培磊，白麗瓊，萬康林，譚云洪

2.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所/傳染病預(yù)防控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206

結(jié)核病被列為我國(guó)重大傳染病之一，是嚴(yán)重危害人民群眾健康的呼吸道傳染病。耐藥結(jié)核病的出現(xiàn)和流行已成為結(jié)核病防治領(lǐng)域的難點(diǎn)和關(guān)注焦點(diǎn)。傳統(tǒng)的藥敏試驗(yàn)存在需時(shí)過長(zhǎng)、操作復(fù)雜、不易標(biāo)準(zhǔn)化和自動(dòng)化等缺點(diǎn)，不能為結(jié)核病的臨床治療提供及時(shí)、有價(jià)值的藥物敏感性相關(guān)資料［1］。尋求快速、準(zhǔn)確、標(biāo)準(zhǔn)的藥敏診斷方法是大勢(shì)所趨。我們采用臨床分離的212株結(jié)核分枝桿菌菌株，BACTEC MIGT960與傳統(tǒng)L－J比例法檢測(cè)8種一線/二線抗結(jié)核藥的藥敏情況進(jìn)行了比較分析，結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本 ，從2010年12月起連續(xù)收集8個(gè)月對(duì)就診于湖南省胸科醫(yī)院的疑似病例的痰標(biāo)本經(jīng)L－J培養(yǎng)基和MGIT960液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，陽性培養(yǎng)物復(fù)均鑒別培養(yǎng)基（PNB/TCH）進(jìn)行菌種鑒定，確診為結(jié)核病者212例。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 全自動(dòng) BA CT ECTM MGIT TM960 TB系統(tǒng)，購置于美國(guó)BD公司。（1）MGl T960用試劑分枝桿菌生長(zhǎng)指示管 （MGIT），生長(zhǎng)添加劑和BACTEc MGIT 960 SIRE試劑盒含SIRE添加劑和4種一線藥物：（INH、RFP、SM、EMB）均為 BD公司產(chǎn)品，4種二線藥物［CPM、KAN、OFLX、ETH）為sigma產(chǎn)品。各藥物在培養(yǎng)基的終濃度參照BD公司《MGIT操作程序指南》［2］（2）L－J方法用試劑L－J法所用對(duì)照和含藥培養(yǎng)基均為改良羅氏培養(yǎng)基，所用8種藥物，其配方和制備按文獻(xiàn)［3］配制。

1.3 藥物敏感性實(shí)驗(yàn) 212例結(jié)核分枝桿菌菌株，分別用MGIT960法和L－J比例法進(jìn)行一線藥物敏感性檢測(cè)。在完成一線藥物的藥物敏感性實(shí)驗(yàn)后，選取90株耐藥菌株（對(duì)任何一種一線藥物耐藥）進(jìn)行二線藥物的藥物敏感性實(shí)驗(yàn)，除去任一方法污染例數(shù)進(jìn)行對(duì)比分析。

1.3.1 MGIT 960法 參照 《MGIT操作程序指南》［2］對(duì)于一線藥物藥敏試驗(yàn)，每株結(jié)核桿菌準(zhǔn)備5支MGIT 960培養(yǎng)管1管為生長(zhǎng)對(duì)照管，4管為加藥管），每管均加人0.8 m L SIRE添加劑，4支加藥管各加入SM、INH、RFP和EMB 100μL，然后，每支加藥管加入0.5 m L菌懸液（報(bào)陽當(dāng)天為第0 d，報(bào)陽第1～2 d的標(biāo)本直接加原液，3～5 d的標(biāo)本需用1∶5無菌生理鹽水稀釋），生長(zhǎng)對(duì)照管（GCT）加1∶100無菌生理鹽水稀釋的菌懸液0.5 m L。將準(zhǔn)備好的 MGIT管按 GCT、SM、INH、RFI、EMB的順序放人AST試管架，系統(tǒng)掃描試管架條形碼，按照儀器指示位置放入BACTEC MGIT 960儀器；MGIT 960儀器會(huì)在4～13 d內(nèi)，根據(jù)Growlh unit值，自動(dòng)報(bào)告耐藥與敏感結(jié)果。二線藥物藥敏試驗(yàn)步驟同一線藥物，但加藥順序、試管擺放順序和所出報(bào)告的順序均為GCT、CPM、KAN、0FLX、ETH。

1.3.2 L－J比例法 參照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》［3］，一線藥物藥敏試驗(yàn)與二線藥物藥敏試驗(yàn)分別進(jìn)行，從報(bào)陽第4～5 d的MGIT管（報(bào)陽后需置于37℃培養(yǎng)箱）吸取適量菌液于含玻璃珠的無菌小瓶?jī)?nèi)，漩渦振蕩幾秒鐘，以0.5%吐溫－80生理鹽水配成1個(gè)麥?zhǔn)媳葷釢舛龋⒂蒙睇}水稀釋至10 mg/m L和10 mg/m L的菌懸液，取稀釋好的菌懸液分別接種于對(duì)照和含藥培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)出時(shí)觀察結(jié)果，根據(jù)耐藥百分比判別：耐藥百分比＝（含藥培養(yǎng)基的菌落數(shù)/對(duì)照培養(yǎng)基的菌落數(shù)）×100%，若耐藥百分比＞l%為耐藥（R），≤l%為敏感（S）。

1.3.3 質(zhì)量控制 一線/二線藥物藥敏實(shí)驗(yàn)的質(zhì)控，在開展一線/二線藥物藥敏試驗(yàn)前，首先對(duì)中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所下發(fā)的10株質(zhì)控菌株，每個(gè)菌株重復(fù)3次試驗(yàn)并將試驗(yàn)結(jié)果報(bào)中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，只有質(zhì)控結(jié)果符合率≥90%以上，方可開展一線/二線藥物藥敏實(shí)驗(yàn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS11.0軟件進(jìn)行分析處理：培養(yǎng)時(shí)間、采用秩和檢驗(yàn)，P＜0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在分析藥敏試驗(yàn)結(jié)果時(shí)，以L－J比例法為判斷標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算MGIT 960法的敏感度、特異性和準(zhǔn)確性，兩種方法檢測(cè)結(jié)果的一致性用Kappa檢驗(yàn)判別，Kappa值≥0.75，說明兩種方法具有較好的一致性，0.75＞Kappa值≥0.4說明兩種方法的一致性一般，Kappa值＜0.4說明兩種方法的一致性不好。

2 結(jié) 果

2.1 MGIT 960法與L－J比例法對(duì)半12份標(biāo)本的藥敏結(jié)果比較，見表1。

2.2 MGIT 960法與L－J比例法檢測(cè)時(shí)間的比較MGIT 960法完成一線藥物藥敏試驗(yàn)的平均時(shí)間為8d，L－J法規(guī)定判讀時(shí)間為28 d，二者的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（表2），MGIT 960法完成二線藥物藥敏試驗(yàn)的平均時(shí)間為10 d，L－J法規(guī)定判讀時(shí)間為28 d，二者的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01）

（表3）。

表1 8種抗結(jié)核藥物藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Comparison on the results between L－J proportional and MGIT960 methods for DST to 8 drugs（strain）

表2 一線藥物藥敏試驗(yàn)測(cè)定所需d數(shù)Tab.2 Average time on completion of DST for the first－line drugs（day）

表3 二線藥物藥敏試驗(yàn)測(cè)定所需d數(shù)Tab.3 Average time on completion of DST for the second－line drugs（day）

3 討 論

我國(guó)是結(jié)核病高耐藥國(guó)家，耐藥結(jié)核病的控制將直接關(guān)系到我國(guó)結(jié)核病控制的成效［3］。BACTEC MGIT 960是美國(guó)BD公司生產(chǎn)的全自動(dòng)分枝桿菌快速培養(yǎng)、鑒定、藥敏液體培養(yǎng)分析系統(tǒng)，主要用于快速培養(yǎng)和一線藥物的藥敏檢測(cè)。目前二線藥物的敏感性診斷也被WHO認(rèn)可并在國(guó)外多家結(jié)核病參比試驗(yàn)室使用［4］，國(guó)內(nèi)有些省份的結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室已在使用MGIT 960進(jìn)行結(jié)核桿菌的快速培養(yǎng)和一線藥敏試驗(yàn)，但未見二線藥敏的開展。目前我國(guó)結(jié)核桿菌的耐藥情況形勢(shì)嚴(yán)峻，只開展一線藥物敏感試驗(yàn)對(duì)復(fù)治難治的耐多藥病人來說，是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。特對(duì)MGIT960一線/二線藥物藥敏快速檢測(cè)技術(shù)做出以下評(píng)價(jià)：

（1）MGIT 960法與傳統(tǒng)的L－J比例法藥敏試驗(yàn)的符合率較好。異煙肼、利福平、鏈霉素、乙胺丁醇、卷曲霉素、卡那霉素、氧氟沙星MGIT 960法的準(zhǔn)確性和Kappa值均大于0.75，說明以上7種藥物MGIT 960法與傳統(tǒng)的L－J比例法藥敏試驗(yàn)具有較好的一致性。乙硫異煙胺Kappaa值0.75＞Kappa值≥0.4，說明兩種方法的一致性一般，這與趙麗麗等［5］的試驗(yàn)結(jié)果基本一致。

（2）MGIT 960法藥敏試驗(yàn)的檢測(cè)時(shí)間明顯短于L－J比例法藥敏時(shí)間。MGIT 960法完成一線藥物藥敏試驗(yàn)的平均時(shí)間為8 d，完成二線藥物藥敏試驗(yàn)的平均時(shí)間為10 d，L－J法藥敏試驗(yàn)平均時(shí)間為30 d。MGIT960法時(shí)間上提前近20多天，避免延誤病情，提高治療結(jié)核病的效率，從而有效地控制結(jié)核病及耐藥結(jié)核病的傳播。

本次臨床試驗(yàn)，采用統(tǒng)一的技術(shù)方案開展研究，MGIT 960法與傳統(tǒng)的L－J比例法藥敏試驗(yàn)的符合率及檢側(cè)時(shí)間結(jié)果經(jīng)與項(xiàng)目省之一遼寧?。?］張娟及國(guó)家參比室趙麗麗［5］等的研究比較，取得一致性效果。說明在已開展MGIT 960法一線藥敏試驗(yàn)的省份，二線藥敏試驗(yàn)值得推廣。

綜合上述，MGIT 960法具有快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，缺點(diǎn)是儀器價(jià)格昂貴，試劑依賴進(jìn)口。在基層小規(guī)模醫(yī)院MGIT 960不太適用，但在結(jié)核病患者較多的大醫(yī)院，更適合應(yīng)用全自動(dòng)的MGIT960儀器，或集中結(jié)核病患者，通過批量培養(yǎng)，也能減少患者個(gè)人的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。到20世紀(jì)80年代后，結(jié)核病的病原學(xué)快速診斷才取得突破性進(jìn)展，如BACTEC法的液體快速培養(yǎng)，在歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家已獲得認(rèn)證，成為廣泛應(yīng)用的方法［7］。

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