大連市“蜱咬”患者新布尼亞病毒（SFTSV）的檢測分析

劉 蕓，張 潔，王 博，田 疆，毛玲玲，孫英偉，王子江，孫婷婷，姚文清，趙 卓

病毒性出血熱是一種臨床癥狀表現(xiàn)為急性發(fā)熱和出血的疾病，病原體為人獸共患及節(jié)肢動物攜帶傳播的RNA病毒。目前在我省最常見的出血熱病毒應(yīng)屬布尼亞科病毒。有致腎綜合征出血熱的漢坦病毒［1－2］和布尼亞病毒［3］。2011年6－8月我省大連地區(qū)的農(nóng)民相繼出現(xiàn)不明原因出血樣癥狀 ，一名“蜱咬”患者因疑似腎綜合征出血熱而就診于大連市第六人民醫(yī)院，我們對其展開了流行病學調(diào)查及實驗室病原體檢測。

1 材料與方法

1.1 樣本

1.1.1 血液樣本 據(jù)流行病學調(diào)查結(jié)果，采集“蜱咬”患者急性期血液樣本及同居住地的26份非患者血清樣本。

1.1.2 蜱蟲樣本 該患者有蜱蟲叮咬史，入院后在其腋下發(fā)現(xiàn)叮咬蜱蟲一只。2011年8月又采集了“蜱咬”患者所在地及相鄰村莊路邊草叢及牛、犬體表叮咬的長角血蜱蟲94只，分成19組，放入不同瓶中標記。

1.2 核酸的提取及檢測 采用QIAGEN公司提供的EZ1 Virus Mini Kit V2.0試劑盒提取RNA，詳細操作步驟按說明書要求進行。采用Real－Time PCR方法檢測SFTSV核酸。核酸檢測試劑盒由中山大學達安基因公司提供。

1.3 血清學檢測 采用ELISA方法對“蜱咬”患者急性期血清樣本進行SFTSV的Ig M抗體檢測；對同居住地的26份非患者血清樣本進行SFTSV的IgG抗體檢測。試劑盒由北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司提供。

1.4 病毒分離 將VERO－E6細胞培養(yǎng)至單層（VERO－E6細胞由中國疾病預(yù)防控制中心病毒所，以下簡稱“病毒所”提供。）接種“蜱咬”患者血清、叮咬的蜱懸液以及19組蜱蟲研磨懸液0.3 mL，吸附2 h后換維持液，盲傳3代，觀察細胞病變（CPE）。新布尼亞病毒致VERO－E6細胞病變特點為細胞被感染9～12 d后出現(xiàn)脫落、溶解變形，呈柳葉狀病變出現(xiàn)緩慢但維持時間長［4］。刮取少量細胞懸液滴入凹孔玻片吹干后冷丙酮固定，并用間接免疫熒光法（IFA）檢測病毒抗原。

1.5 病毒滴度測定 將處于對數(shù)生長期的VERO－E6細胞接種96孔細胞培養(yǎng)板，用Hanks液將分離的病毒倍比稀釋為10－1～10－1212個濃度的病毒液，每孔接種病毒液100 μL，平行4孔，吸附2 h后棄Hanks液，補加 MEM維持液300μL，5%CO2、37℃培養(yǎng)15 d觀察細胞病變。Karber法計算TCID50。

1.6 病毒鑒定 采用7對SFTSV的M片段全基因測序引物對分離到的毒株進行RT－PCR擴增，并對擴增產(chǎn)物進行測序。SFTSV的M片段的RT－PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件全部由病毒所提供。

2 結(jié) 果

2.1 血清學檢測 “蜱咬”患者急性期血清樣本SFTSV的Ig M抗體陽性、IgG抗體陰性；26份非患者血清樣本中4份SFTSV的IgG抗體陽性。

2.2 核酸檢測 “蜱咬”患者血液樣本及其叮咬的蜱蟲SFTSV核酸陽性，采集的94份長角血蜱樣本SFTSV核酸均為陰性。

2.3 病毒分離及滴度測定 牛、羊、犬體表叮咬的蜱蟲懸液細胞培養(yǎng)均為陰性?！膀缫А被颊哐杭捌涠ＲУ尿缦x經(jīng)VERO－E6細胞培養(yǎng)后均獲得陽性分離株。分別被命名為：LNDL－2011－XQ（遼寧大連－2011年－血清分離株），LNDL－2011－PC（遼寧大連－2011 年－蜱 蟲 分 離 株 ）。 對 LNDL－2011－XQ 株、LNDL－2011－PC株及我省撫順和丹東的分離株同時進行病毒滴度測定，結(jié)果大連分離株滴度為10－6，其他地區(qū)為10－5。

2.4 系統(tǒng)發(fā)生分析RT－PCR產(chǎn)物用QIAGEN膠純化試劑盒（QIA quick Gel Extraction K it）純化，操作按試劑盒說明書。純化后產(chǎn)物送上海英維捷基（Invitrogen）貿(mào)易有限公司進行序列測定。測序結(jié)果的比對及相似性分析使用軟件Bioedit；同源性分析以及進化樹的構(gòu)建通過MEGA4完成。用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹的SFTSV病毒各基因型代表株的參比序列來自NCB I的GenBank。見圖1。

圖1 新布尼亞病毒分離株M基因遺傳進化分析Fig.1 Phylogenetic tree of M gene in SFTSV strains

3 討 論

患者臨床癥狀、體征及血清學檢測結(jié)果顯示為新布尼亞病毒感染者。雖然其家人或其他密切接觸者未發(fā)生感染。因病人血液中病毒含量較高，初代培養(yǎng)時細胞呈現(xiàn)明顯的病變，不排除有人傳人的可能性。健康人群調(diào)查表明：有隱性感染者存在，因樣本量太少目前還不能確定正常人群自然感染后抗體的保護水平。有待于在今后的監(jiān)測工作中進一步完善。

傳播媒介的調(diào)查結(jié)果顯示，在患者居住的村莊及周邊山村小路采集的野外長角血蜱與動物體表叮咬的蜱蟲均未檢測到SFTSV抗原，可能與樣本量少有關(guān)。但患者體表叮咬的蜱新布尼亞病毒分離成功，這一結(jié)果將進一步提示，該病可能為一種由蜱傳播的自然疫源性疾?。?－6］。

表1 患者和蜱蟲病毒分離株M基因核苷酸與其他新布尼亞病毒分離株同源性比較Tab.1 Homology comparison on partial nucleotide sequence of SFTSV M gene from patient and tick to other strains（%）

SFTSV屬于布尼亞病毒科白蛉病毒屬，為分節(jié)段的負鏈RNA病毒，病毒顆粒呈球形，直徑80－100nm，病毒基因組分為L、M、S 3個片段［7］。系統(tǒng)發(fā)生分析表明：大連地區(qū)SFTSV分離株（LDL2011－PC，LDL2011－XQ及LDL2011－15）與國際標準的白蛉病毒株序列親緣性較近但存在著明顯的不同種的現(xiàn)象，且存在著明顯的地域聚集特點，區(qū)別于我省丹東分離株；其次，抗原滴度測定表明大連分離株較其它地區(qū)分離株滴度高毒力強。從患者體表叮咬的蜱蟲分離株與該患者血清分離株M片段堿基序列做比對同源性達99.7%，說明該患者的發(fā)病與其叮咬的蜱蟲自身攜帶的病毒有密切關(guān)系。大連地區(qū)分離株與遼寧2號株（LN2：遼寧撫順株）、丹東株（LDD2011－1）及河南6號株遺傳距離較近。

試驗與調(diào)查結(jié)果顯示：即我省丹東、撫順、鐵嶺地區(qū)自2009起因獲得SFTSV分離株被確定為疫區(qū)外，大連地區(qū)亦成為新布尼亞病毒存在的疫源地。

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