北沙參多糖對甲亢型陰虛小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用

榮立新，魯 爽，劉詠梅

(中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院，北京 100053)

北沙參為傘形科植物珊瑚菜(Glehnia littoralis Fr.Schmidt exMiq.)的干燥根，有養(yǎng)陰清肺、益胃生津的功效。研究表明，多糖是其中主要成分，可增強機體免疫功能［1，2］。本實驗觀察了北沙參粗多糖(GLP)［1］對陰虛小鼠的免疫調(diào)節(jié)現(xiàn)象，以揭示其滋陰作用的免疫調(diào)節(jié)機制，并進一步探討中藥的陰陽平衡理論。

1 材料

小牛血清(杭州四季青生物材料公司)，甲狀腺素(萊陽生物化學制藥廠)，利血平(上海醫(yī)科大學紅旗制藥廠)，PRMI 1640培養(yǎng)液(美國 Gibco公司)，所用試劑均為分析純。J2-MC BECKMAN高速冷凍離心機(Bechman公司)，S22PC分光光度計(上海棱光技術有限公司)，HHS型電熱恒溫水浴鍋(江蘇金壇市宏凱儀器廠)。昆明種雄性小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量20±2g(濰坊醫(yī)學院實驗動物中心，動物合格證號魯動環(huán)字200007001號)。

2 方法與結(jié)果

2.1 GLP的提取

稱取加工后的北沙參根250 g，加蒸餾水1500 ml，浸泡30 min，回流提取5 h，抽濾、濾液加95%乙醇至含醇量達50%，靜置過夜，傾出上清液，離心5 min，用50%乙醇洗滌(100 ml×3)，50℃烘箱烘干，過30目篩，得乳白色GLP粗制品［3］。

將制得的GLP粗品加水溶解用三氯乙酸法去游離蛋白質(zhì)，然后置透析袋透析2 d，換水2次去小分子雜質(zhì)，將沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌、離心，置50℃烘箱烘干，過30目篩，得白色GLP。

2.2 GLP的含量測定

用硫酸-蒽酮法測得GLP含量為63.88%。

2.3 動物分組及給藥

小鼠40只隨機分為5組，每組8只，分別為正常對照組［生理鹽水20 ml/(kg·d)］、模型對照組、GLP高劑量組［800 mg/(kg·d)］、GLP 中劑量組［600mg/(kg·d)］、GLP 低劑量組［400 mg/(kg·d)］。每日上午除正常對照組灌服生理鹽水外，其余各組均灌胃給予甲狀腺片150 mg/kg和利血平1 mg/kg，下午GLP各劑量組分別灌胃給予受試藥物，連續(xù)6d，各組動物實驗前后各稱體質(zhì)量以計算體質(zhì)量增加值并觀察其外觀變化。

2.4 統(tǒng)計學方法

統(tǒng)計學方法采取兩均數(shù)比較t檢驗。

2.5 GLP滋陰作用的整體效應觀察

小鼠給予甲狀腺素和利血平造模4d后，開始出現(xiàn)體質(zhì)量減輕、身體瘦長、躁動不安，有的出現(xiàn)兩眼不張、行動遲緩甚至死亡。GLP各劑量組動物各種虛象較輕;正常對照組動物外觀和行為均正常。

表1顯示，模型組動物體質(zhì)量增加值明顯低于正常對照組，GLP各劑量組的體質(zhì)量增加顯著高于模型組(P＜0.01，P＜0.05)，表明陰虛動物體質(zhì)量降低，而GLP能顯著增加其體質(zhì)量且呈劑量關系，其中GLP高劑量組接近正常水平。

2.6 GLP對模型小鼠脾臟NK殺傷活力影響

2.7 GLP對模型小鼠T淋巴細胞轉(zhuǎn)化的影響

表1顯示，將各組小鼠給藥后第7天處死，取脾臟組織制備脾細胞懸液，參照文獻［4］采用MTT比色方法檢測各組小鼠刺激指數(shù)(SI)。結(jié)果小鼠造模后，其刺激指數(shù)明顯降低(P＜0.01)，GLP高、中劑量組對陰虛小鼠的脾臟T細胞轉(zhuǎn)化功能均有顯著增強作用(P＜0.01，P＜0.05)，接近正常水平。

2.8 GLP對模型小鼠血清抗綿陽紅細胞抗體IgM，IgG含量的影響

將各組小鼠給藥后第7天處死，取小鼠血清，參照文獻［4］采用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)方法檢測抗綿羊紅細胞抗體IgM、IgG的含量。

表1顯示，陰虛模型小鼠血清IgM，IgG抗體水平與正常組比較明顯降低(P＜0.05)，北沙參多糖的中劑量和低劑量組對IgM抗體的生成有顯著增強作用(P＜0.05)，北沙參多糖高劑量組和低劑量組則對IgG抗體的產(chǎn)生有顯著增強作用(P＜0.05)。

表1顯示，將各組實驗動物于給藥后第7天處死，取脾臟組織制備脾細胞懸液，參照文獻［4］采用MTT比色法檢測各組小鼠NK細胞對靶細胞的殺傷率(%)。結(jié)果模型小鼠脾臟NK細胞殺傷活力明顯低于正常對照組(P＜0.01)，GLP高劑量組可顯著提高陰虛小鼠的NK殺傷率(P＜0.05)，接近正常值。

表1GLP干預對各組小鼠體質(zhì)量變化和各項免疫功能指標的影響(±s)

表1GLP干預對各組小鼠體質(zhì)量變化和各項免疫功能指標的影響(±s)

注:與模型組比較:＊＊P ＜0.01，*P＜0.05

組別 例數(shù) 給藥劑量/(mg/kg)體質(zhì)量增加值/g NK細胞殺傷率(%)T細胞轉(zhuǎn)化指數(shù) IgM(lgR) IgG(lgR)正 常 對 照 組 8 5.25±1.04＊＊ 30.01±0.05＊＊ 2.30±0.58＊＊ 4.10±0.02* 2.20±0.02*陰 虛 模 型 組 8 2.57±1.07 18.73±0.03 1.08±0.15 3.60±0.04 1.80±0.02模型 +GLP高劑量組 7 800 4.71±1.11＊＊ 27.52±0.44＊＊ 1.67±0.36＊＊ 4.05±0.03 2.20±0.3*模型 +GLP中劑量組 8 600 3.75±0.89* 22.10±0.09 1.46±0.32＊＊ 3.35±0.05* 1.95±0.05模型 +GLP低劑量組 7 400 3.43±1.40 20.47±0.17 1.03±0.18 3.15±0.03* 2.00±0.04*

3 討論

北沙參屬常用補陰藥，多用于陰虛肺熱等癥，具有補虛扶正祛邪的功效。文獻記載北沙參可增強細胞免疫、體液免疫［6～8］。采用甲狀腺素和利血平誘導建立小鼠甲亢陰虛證模型，具有方法簡便、成功率高、死亡率低、穩(wěn)定性強、重復性好等優(yōu)點，是深入研究陰虛病因機理的常用動物模型制作方法［9，10］。本實驗對小鼠造模后，發(fā)現(xiàn)其出現(xiàn)體質(zhì)量減輕、身體瘦長、躁動不安等現(xiàn)象，符合中醫(yī)陰虛證的臨床表現(xiàn)，說明本實驗塑造的陰虛動物模型是成功的。同時發(fā)現(xiàn)，動物處于陰虛狀態(tài)時，體內(nèi)非特異性免疫、細胞免疫和體液免疫功能指標均有不同程度的降低，表明由甲狀腺素和利血平所誘發(fā)引起的小鼠陰虛癥的發(fā)病機制，與機體免疫功能有著內(nèi)在、直接的聯(lián)系，由陰虛引起的各項病理變化，有可能是通過降低機體的免疫功能而引發(fā)的。本研究結(jié)果顯示，GLP可顯著提高陰虛小鼠的NK殺傷率(P＜0.05)和血清IgM和IgG含量，對脾臟T淋巴細胞轉(zhuǎn)化功能均有顯著促進作用(P＜0.01或P＜0.05)。表明GLP對陰虛小鼠的非特異性免疫、細胞免疫和體液免疫功能均有顯著增強作用。提示北沙參對陰虛癥的治療作用，可能與其中的多糖成分參與調(diào)節(jié)機體的免疫狀態(tài)，從而使失調(diào)的功能恢復至正常生理平衡狀態(tài)有關。其具體調(diào)節(jié)作用機制及其他成分對免疫功能是否也有調(diào)節(jié)作用，尚有待進一步研究［11］。

［1］石俊英，李寶國，牟彩萍.山東地產(chǎn)藥材北沙參多糖含量測定［J］.山東中醫(yī)藥大學學報，2002，26(2):139-142.

［2］譚允育，康娟娟，王娟娟.沙參對正常小鼠免疫功能影響的實驗研究［J］.北京中醫(yī)藥大學學報，1999，22(6):39-44.

［3］屠鵬飛，徐國鈞，徐珞珊，等.沙參類的研究Ⅲ.多糖的含量測定［J］.中草藥，1992，23(7):355-366.

［4］司傳平.醫(yī)學免疫學實驗［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1999:7-53.

［5］李儀奎.中藥藥理實驗方法學［M］.上海:上?？茖W技術出版社，1991:272.

［6］李儀奎，姜名瑛.中藥藥理學［M］.北京:中國中醫(yī)藥出版社，1992:180.

［7］呂方軍，葉國華，許一平，等.北沙參莖葉提取液對免疫抑制小鼠免疫功能的影響［J］.時珍國醫(yī)國藥，2012，23(4):936-937.

［8］馮蕾，楊憲勇，冀海偉，等.北沙參超臨界二氧化碳萃取物對免疫抑制小鼠免疫功能的影響及成分分析［J］.中國醫(yī)院藥學雜志，2010，30(20):1740-1742.

［9］付曉伶，方肇勤.陰虛證動物模型的造模方法及評析［J］.上海中醫(yī)藥大學學報，2004，18(2):51-54.

［10］王祎媛，侯連兵，蔡鴻福，等.甲狀腺素和利血平誘導小鼠甲亢陰虛證模型的制備［J］.藥物研究，2010，19(23):19-20.

［11］劉詠梅，劉波，王金鳳，等.北沙參粗多糖的提取及對陰虛小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用［J］.中國生化藥物雜志，2005，7:224-225.