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    黃連解毒湯對自發(fā)性糖尿病大鼠免疫炎癥因子及損傷的影響

    2013-08-21 13:32:28萍,李
    關鍵詞:勻漿黃連微血管

    姜 萍,李 曉

    (山東中醫(yī)藥大學附院內(nèi)科,濟南 250011)

    自發(fā)性糖尿病大鼠(Goto-Kakizaki diabetes prone rat,GK大鼠)是研究糖尿病的較好模型,比目前常用的鏈脲霉素模型更能符合人類2型糖尿病特點。在糖尿病心肌病變發(fā)展過程中,研究顯示炎癥因子可造成微血管及心肌的損傷[1],從中醫(yī)病因病機學說可概括歸納為糖毒蘊結、熱毒耗傷心絡心體。黃連解毒湯是清熱解毒的代表方劑,本實驗采用GK大鼠主要觀察黃連解毒湯對自發(fā)性糖尿病大鼠心肌炎癥因子的影響及對心肌損傷的防治作用,為防治糖尿病心肌病變提供新思路和證據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 動物及分組

    GK3月齡雄性大鼠30只(中國科學院上海實驗動物中心,批號0005569),體質(zhì)量210~300g,隨機分為黃連解毒湯組、二甲雙胍組、GK對照組3組。另取普通級4月齡雄性Wister大鼠10只作為正常對照組,體質(zhì)量330~410g(山東大學新藥評價中心提供,動物合格證號200203)。

    1.2 藥品及試劑

    實驗用藥:按照黃連解毒湯原方比例制備水煎劑,濃縮至1g生藥/ml(山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院制劑室完成),將二甲雙胍等配制成合適的懸濁液。

    試劑:核因子-κB(goat anti Nuclear factor-κB,NF-κB);酶聯(lián)免疫試劑盒(美國adlitteram diagnostic laboratories INC,ADL CD A-011,LOT RT110371);細胞間黏附分子(sICAM-1)酶聯(lián)免疫試劑盒(美國R&D Systems Inc,Cat No:SXR060 Lot No.0701120,中國尚柏公司代理);白介素-1(IL-1)酶聯(lián)免疫試劑盒(美國R&D Systems Inc,Cat No:SXR019 Lot No.:0701119);Sun Biomedical Technology Co.,Ltd 中國尚柏公司代理);腫瘤壞死因子(TNF-α)放射免疫試劑盒;內(nèi)皮素(ET-1)放射免疫試劑盒(北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司,原北京東亞免疫技術研究所)。主要實驗儀器:勻漿機(IKA-ULTRA-TURRAX T 25basic);ELx808酶標儀(美國 BIO-TEK INSTRUMENTS,INC);GMJ型全自動放射免疫γ計數(shù)器(江蘇省醫(yī)療電子研究所);DDL-5冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠)。

    2 方法

    2.1 分組用藥

    給藥劑量相當于人口服10倍量。各組按以下方式飼養(yǎng)及灌胃給藥12周。各組給予正常飼料喂養(yǎng)的同時分組給藥,黃連解毒湯組給予水煎劑9.0g/kg·d,西藥組給予二甲雙胍0.125g/kg·d,正常對照組和GK對照組分別給予生理鹽水2mL/kg·d。

    2.2 標本處理及制作

    按上述方法灌胃12周,因動物灌胃等死亡,黃連解毒湯組9只,其他組均為8只。禁食不禁水12h,以上動物行氯胺酮腹腔麻醉、解剖,腹主靜脈取血,采用強生公司One Touch Profile血糖儀測定血糖。取心臟立即用預冷的生理鹽水沖洗,沖洗后在冰上操作,沿左心室方向解剖。用4%多聚甲醛固定,連續(xù)做病理切片,片厚5um,行HE染色。取新鮮心肌組織,每克心肌組織加5ml生理鹽水置勻漿機上10000r/min 10s×3次,制備20%心肌組織勻漿,4000r/min離心10min,取上清液4℃保存待測。

    2.3 觀察項目及檢測方法

    NF-κB、sICAM-1、IL-1 采用酶標雙抗體夾心法測定。根據(jù)曲線方程計算各樣品NF-κB、sICAM-1、IL-1濃度。TNF-α、ET-1采用放免法測定,由儀器自動計算各樣品含量。取各組心肌HE染色切片光鏡下觀察。

    2.4 統(tǒng)計學處理

    所有數(shù)據(jù)均由SPSS統(tǒng)計軟件包統(tǒng)計處理。各組均數(shù)以均值±標準差(±s)表示,各組數(shù)據(jù)均進行方差齊性檢驗后采用方差分析,均值間兩兩比較用t檢驗。

    3 結果

    3.1 各組動物血糖及心肌勻漿炎癥因子含量

    表1顯示,計算各組動物血糖及心肌勻漿NF-κB、sICAM-1、IL-1、TNF-α、ET-1 等炎癥因子含量。

    表1 各組大鼠血糖及心肌勻漿炎癥因子比較(±s)

    表1 各組大鼠血糖及心肌勻漿炎癥因子比較(±s)

    組 別 例數(shù) 血糖(mmol/L)NF-κB(ng/ml)sICAM-1(ng/ml)TNF-α(pg/ml)IL-1(pg/ml)ET-1(pg/ml)正 常 大 鼠 8 4.27±0.88 236.20± 53.70 306.20± 58.60 350.60±31.30 53.62±11.00 48.10± 3.70 GK 對 照 8 8.72±0.73★★ 609.80± 49.40★★ 501.90± 75.70★★ 833.12±31.60★★ 96.77±31.35★★ 160.00± 7.28★★二 甲 雙 胍 8 6.14±0.90** 601.03±154.90 422.98±129.27 776.25±15.90** 75.78±11.50* 141.67±28.70黃連解毒湯組 9 5.70±0.74** 533.73± 65.90**△ 392.78± 66.20** 602.70±40.30**△△ 55.93±12.80*△△ 105.35± 7.10**△△

    注:GK對照組與正常大鼠組比較:★P<0.05,★★P<0.01;各組與GK對照比較:*P<0.05,**P<0.01;中藥組與二甲雙胍組比較:△P<0.05,△△P<0.01

    表1顯示,與正常對照組比較,GK對照組血糖明顯升高,黃連解毒湯組、二甲雙胍組血糖均下降,差異有非常顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01),2藥物組之間差異無統(tǒng)計學意義。

    與正常對照組比較,GK對照組各炎癥因子明顯升高(P<0.01)。與GK對照組比較,二甲雙胍組IL-1、TNF-α下降(P<0.05),黃連解毒湯組各炎癥因子明顯降低(P<0.05),黃連解毒湯與二甲雙胍比較,各炎癥因子下降程度較大,其中 NF-κB、TNF-α、ET-1差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

    綜上分析,黃連解毒湯和二甲雙胍能均能顯著降低血糖,但在降低炎癥因子方面,黃連解毒湯優(yōu)于二甲雙胍。

    3.2 切片鏡下觀察所見

    正常大鼠可見心肌纖維清晰,心肌排列規(guī)則,未見變性壞死和炎細胞浸潤(見圖1)。GK對照組可見部分心肌纖維呈灶性肥大,并見較多細小空泡,心肌細胞變大變寬,核偏向一側,部分心肌纖維橫紋消失,部分心肌呈蜂窩狀僅存肌膜,心肌間質(zhì)纖維結締組織增生(見圖2)。二甲雙胍組部分心肌纖維呈灶性肥大,心肌細胞變大變寬,核偏向一側,程度有所減輕,部分心肌間質(zhì)纖維結締組織增生(見圖3)。黃連解毒湯組病變的心肌纖維程度明顯減輕,僅見個別心肌細胞肥大,核偏位(見圖4)。

    4 討論

    黃連解毒湯收載于唐·王燾所著的《外臺秘要》,由黃連、黃芩、黃柏、梔子4味中藥組成,具有瀉火解毒之功效,是清熱解毒的代表方。既往研究證明,黃連解毒湯有抗炎、抗氧化、降血糖、降血脂之功效,可多靶點改善胰島素抵抗等[2],其抗炎作用與抑制IL-1、TNF-α等炎癥因子表達、抑制中性粒細胞與血管內(nèi)皮黏附有關[3]。近年來研究表明,黃連解毒湯可提高2型糖尿病脂肪和肌肉組織中葡萄糖轉(zhuǎn)運子4的蛋白表達及轉(zhuǎn)位[4],可降低2型糖尿病大鼠血清中白介素1、4、6、10、腫瘤壞死因子、C 反應蛋白的水平[5,6]。

    糖尿病早期即可出現(xiàn)微血管內(nèi)皮功能損傷和血管活性物質(zhì)分泌異常[7],目前對糖尿病心肌及微血管病變的確切發(fā)病機理尚未完全闡明,涉及糖基化終產(chǎn)物(AGEs)形成、多元醇通路活躍、氧化應激增加、己糖通路活躍、蛋白激酶 C(PKC)激活等等[8,9]。在上述多種機制中,高血糖可增強氧化應激,氧化應激可激活幾乎所有已知的有關信號傳導通道,通過激活核因子-κB(NF-κB)上調(diào)黏附分子及炎性因子基因轉(zhuǎn)錄[10]。糖基化終產(chǎn)物(AGEs)也可激活蛋白激酶通路及 NF-κB 信號通路[11]。

    圖1 正常對照組(HE染色×200倍)

    圖2 GK對照組(HE染色×200倍)

    NF-κB能引起一系列參與炎癥和免疫反應基因的表達增加,如 TNF-α、IL-1、sICAM-1、ET-1、血管細胞黏附分子、選擇素等,反過來,TNF-α和IL-1又能激活NF-κB,NF-κB 起著中心調(diào)控作用[12]。多種免疫應答、炎癥反應、細胞黏附等有關的細胞因子作用于微血管內(nèi)皮細胞或血細胞,導致局部炎癥、微循環(huán)障礙的發(fā)生,隨著病程延長,微血管、心肌損傷、心肌纖維化,最終導致糖尿病心肌病變。因此,糖尿病心肌病變是一種輕度的亞急性或慢性炎癥性病變[13]。

    糖尿病屬中醫(yī)學“消渴”范疇,一般認為其病機為“陰虛燥熱”,我們認為糖尿病心肌病變的中醫(yī)基本病機為燥熱郁久、糖毒蘊結、火化為毒、熱毒內(nèi)蘊、耗傷心絡心體。糖尿病心肌損傷的病理生理機制比較復雜,目前尚未完全闡明,炎癥損傷是其病理過程之一。本文對炎癥損傷過程進行中醫(yī)理論探索,認為既是病理產(chǎn)物又是致病因素的炎癥因子符合中醫(yī)學“內(nèi)生之毒”的性質(zhì),高血糖及炎癥過程導致心肌損傷的病理機制與中醫(yī)學的“熱毒傷絡、心體失養(yǎng)”有非常密切的相關性。我們既往的臨床及實驗研究[14~17]顯示,以清熱解毒為治法的心和顆粒劑調(diào)心飲,對不穩(wěn)定心絞痛有確切療效,可降低患者、高脂血癥大鼠模型、動脈粥樣硬化家兔模型中有關炎癥因子含量及抑制心肌組織中NF-κB的表達等作用。

    目前尚未見黃連解毒湯針對糖尿病心肌炎癥損傷的報道。有學者認為,毒邪內(nèi)蘊是導致糖尿病等代謝性疾病的重要原因之一,與炎癥有關的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB信號通路對上述疾病發(fā)生和發(fā)展具有關鍵的調(diào)控作用,黃連解毒湯對上述疾病的治療作用,可能源于對多種細胞因子的調(diào)節(jié)作用,由此認為對闡明黃連解毒湯的異病同治原理具有意義[18]。鑒于糖尿病的慢性炎癥病理特點,我們探討黃連解毒湯對糖尿病心肌病變的防治作用。

    本實驗檢測自發(fā)性糖尿病大鼠心肌勻漿中有關炎癥因子含量。從實驗結果分析,二甲雙胍能顯著降低IL-1、TNF-α,其原因可能與降低血糖有關。黃連解毒湯也能降低血糖,并能夠顯著降低NF-κB、sICAM-1、IL-1、TNF-α、ET-1 等,并在降低 NF-κB、TNF-α、ET-1方面優(yōu)于二甲雙胍,顯示了抗炎的獨特作用。病理切片顯示,能顯著減輕心肌損傷。

    本實驗進一步證明了黃連解毒湯能夠降低心肌勻漿中炎癥因子含量,可防治心肌炎癥損傷,為糖尿病心肌病變的治療提供了新證據(jù)。

    圖3 二甲雙胍組(HE染色×200倍)

    圖4 黃連解毒湯組(HE染色×200倍)

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