黃芪桂枝五物湯對STZ誘發(fā)糖尿病大鼠周圍神經(jīng)保護作用

齊 峰，邱昌龍，朱 亮，趙 舒，楊小溪

(河北聯(lián)合大學中醫(yī)學院，河北唐山 063000)

糖尿病累及周圍神經(jīng)系統(tǒng)可產生糖尿病周圍神經(jīng)病變(Diabetic Peripheral Neuropathy DPN)，而且可隨病程的延長而加重，是糖尿病致殘、致死的主要原因之一［1］。黃芪桂枝五物湯是我們臨床常用的治療DPN基本處方之一，且近年來因其療效確切而屢見報道［2～5］。為進一步探明其作用效果和機制，我們開展了如下研究。

1 材料與方法

1.1 動物

8周齡健康雄性Wistar大鼠，體質量200～220g(SCXK(京)2011-0005)，由河北聯(lián)合大學實驗動物中心代購。

1.2 藥物

黃芪桂枝五物湯:黃芪15g，桂枝 15g，白芍15g，生姜30g，大棗4枚(15g)組成，成人每日處方生藥量為 90g。藥材加水 300ml，浸泡 30min，煎30min，二煎加水200ml，煎20min，將2次煎汁混勻，水浴濃縮為165%(1ml含1.65g生藥)的藥液，4℃保存?zhèn)溆谩Ｋ杷幉膹谋本┩侍锰粕椒植恳淮涡再徺I;彌可保片(080626)500ug/，日本衛(wèi)材(中國)藥物有限公司。

2.2 主要試劑和儀器

鏈脲佐菌素(STZ):sigma公司產品(lg/瓶，批號S0130);NGF(免疫組化試劑盒)，北京博奧森生物科技公司;JT502N電子天平:上海倫捷;SZ-97自動三重純水蒸餾器:上海亞榮生化儀器廠。

1.3 溶液配置

檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液(pH值4.2～4.5)的配置:取2.1g檸檬酸加入雙蒸水100ml配成A液，取2.94g檸檬酸鈉加入雙蒸水100ml配成B液。用時將A、B液按1∶1.32比例混合，pH計測定pH值，調節(jié)pH=4.2～4.5，即是所需配置STZ的檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物造模與分組 選取8周齡健康雄性Wisart大鼠，體質量200～220g，自然光線，不限制飲水，適應性喂養(yǎng)l周后禁食12h，將鏈脲佐菌素用0.1mmol/L檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液(pH4.2，4℃)避光條件下配成1%濃度溶液，按50mg/kg劑量左下腹腔內單次注射，72h后尾靜脈取血測血糖，凡血糖≥16.7mmol/L作為糖尿病大鼠。將50只糖尿病大鼠隨機分為模型組(A)、彌可保組(B)、黃芪桂枝五物湯低(C)、中(D)、高劑量組(E)5組。5組動物的血糖水平在研究基礎上一致，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。另取10只同批無差異大鼠作為正常對照組(F)。

1.4.2 給藥方法 模型復制1周后，加味黃芪桂枝五物湯低、中、高劑量組分別按4.5g/kg、9 g/kg、12.5g/kg劑量灌胃給藥，正常組和模型組灌服等容積的蒸餾水，彌可保組按375ug/kg灌胃，灌胃每日1次，連續(xù)8周給藥后取標本進行檢測。所需藥液用蒸餾水定期配制，4℃冰箱保存，大鼠實驗期間按組分籠飼養(yǎng)，標準飼料自由攝食、飲水。

1.4.3 檢測指標及方法

1.4.4 坐骨神經(jīng)傳導速度檢測 第8周治療結束后，以戊巴比妥鈉30mg/kg腹腔注射麻醉動物，在麻醉狀態(tài)下經(jīng)十六導電生理儀檢測大鼠坐骨神經(jīng)運動傳導速度(MNCV)［6］。用2個電極針經(jīng)皮插入，第一刺激部位在坐骨窩，第二刺激部位在踝部，電極間距為2mm，接地于尾部，用方形波(10～20mA，40us脈波寬)刺激坐骨神經(jīng)，用2個針電極在同側的足部骨間肌記錄復合肌肉動作電位。記錄3對不同的M波潛伏期取其平均值，近端和遠端的潛伏期差值作為運動神經(jīng)在2個刺激部位間的傳導時間，再測量出2個刺激部位間的距離。根據(jù)公式計算MNCV(m/s)=距離/潛伏期差值，同樣方法檢測大鼠坐骨神經(jīng)感覺傳導速度:(SNCV)=距離/潛伏期差值。

1.4.5 大鼠NGF表達 上述步驟完成后，大鼠在麻醉狀態(tài)下迅速剝離大腦海馬組織，置于4%的多聚甲醛固定液中固定。常規(guī)石蠟包埋、切片，以75%明膠處理過的載玻片接片，60℃烘片30min備用。所有步驟嚴格按照免疫組化試劑盒說明進行操作，圖片分析采用HPIAS-1000高清晰彩色病理圖文分析系統(tǒng)進行圖像分析。每鼠取切片5張，400倍鏡下檢測各片的平均光密度值并計算 density值，分別測定后累加取其平均值，即為density值。終值單位為像素點，檢測場面積為15萬個像素點。

2 統(tǒng)計學方法

選用SPSS 17.0 for windows統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，各項實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，各組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間比較采用q檢驗。

3 結果

3.1 一般情況

實驗期間，正常組大鼠精神狀態(tài)良好，動作自如，毛色光澤。其余各組大鼠均出現(xiàn)多飲、多食、多尿、消瘦，皮毛污穢無光澤，精神萎靡，蜷臥拱背、后肢活動不靈活甚至痿廢不用等現(xiàn)象。實驗過程中模型組大鼠于第3周死亡2只，經(jīng)解剖死于巨結腸，黃芪桂枝五物湯低劑量組1只于實驗第1周死于灌胃不當，其余組別大鼠未見死亡。

3.2 坐骨神經(jīng)傳導速度

表1顯示，模型組大鼠坐骨神經(jīng)傳導速度表達明顯低于其他各組，提示周圍神經(jīng)病變明顯，各治療組與模型組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01或0.001)，提示藥物干預具有不同提高坐骨神經(jīng)傳導速度作用，其強弱順序為F組＞E組＞D組＞C組＞B組。

表1 藥物干預8周后不同組別坐骨神經(jīng)傳導速度

3.3 神經(jīng)生長因子的表達

表2圖1顯示，模型組大鼠NGF表達明顯低于其他各組，各治療組與模型組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01或0.001)，提示藥物干預具有不同促進NGF表達的作用，其強弱順序為F組＞E組＞D組＞C組＞B組。

表2 藥物干預8周后不同組別神經(jīng)生長因子的表達

圖1 光鏡下神經(jīng)生長因子比較

4 討論

目前國內外廣泛認可的使用鏈脈佐菌素(STZ)制備糖尿病動物模型(血糖值大于16.65mmo1/L作為糖尿病大鼠空腹或非空腹的成模標準)［7］，因其同時具備了人類糖尿病性周圍神經(jīng)病變的特點［8］，從而被廣泛地應用于DPN的實驗研究之中。坐骨神經(jīng)傳導速度降低是糖尿病大鼠模型的周圍神經(jīng)病變特點之一［9］。DPN時，神經(jīng)功能的改變先于并伴隨神經(jīng)解剖的損害，因而神經(jīng)電生理檢查作為早期診斷DPN的敏感指標被大家認可;臨床上許多DPN患者在出現(xiàn)運動、感覺障礙之前就有明顯的神經(jīng)傳導速度減慢［10］現(xiàn)象，神經(jīng)傳導速度減慢被看做是糖尿病性神經(jīng)病變發(fā)生的先兆之一，這也是該項檢測成為目前評價糖尿病患者神經(jīng)功能最常用指標的原因;神經(jīng)生長因子(NGF)是最先發(fā)現(xiàn)的細胞生長調節(jié)因子，NGF是交感神經(jīng)元、感覺神經(jīng)元和中樞部分膽堿能神經(jīng)元生長、發(fā)育、存活、維持功能所必需的營養(yǎng)因子，其生物學活性主要是維持交感神經(jīng)和感覺神經(jīng)的功能，能誘導神經(jīng)遞質的合成、蛋白磷酸化、甲基化以及類似ras蛋白的基因表達所需酶的合成，能有選擇地營養(yǎng)交感神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的小纖維感覺神經(jīng)元。已有實驗證明，無論是糖尿病動物模型還是糖尿病神經(jīng)病變患者，其組織或血中的NGF水平均明顯降低［11-12］。本次實驗觀察到，模型組大鼠坐骨神經(jīng)傳導速度明顯降低，神經(jīng)生長因子表達明顯下調，與正常對照組比較差異有極顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，提示模型組大鼠具備DPN的特點。

目前，西醫(yī)針對DPN缺乏理想的治療方法［13］，中醫(yī)學從整體出發(fā)，調理陰陽，對于該病復雜病理機制，中藥復方的作用呈現(xiàn)出多途徑、多靶點和多系統(tǒng)的特點，尤其是在改善患者癥狀、提高生活質量及遠期療效上顯示了獨特的優(yōu)勢，是單靶點和單系統(tǒng)化學合成藥不可比擬的。因此，充分發(fā)揮中醫(yī)藥簡便效廉的特點，開發(fā)有效中藥復方，對解決DPN這一臨床難題是切實可行的。黃芪桂枝五物湯出自《金匱要略》:“血痹，陰陽俱微，寸口關上微，尺中小緊，外證身體不仁，如風痹狀，黃芪桂枝五物湯主之。”方中黃芪為君藥，甘溫益氣固表;桂枝散風寒而溫經(jīng)通痹;芍藥養(yǎng)血和營而通血痹，與桂枝合用，調和營衛(wèi)而和表里，兩藥為臣;生姜辛溫，疏散風邪，以助桂枝之力;大棗甘溫，養(yǎng)血益氣以資黃芪、芍藥之功，兩藥為佐使，5味藥物配伍精當，共奏養(yǎng)血祛風、益氣通絡、調和營衛(wèi)之功。臨床之中以身體外周痛、癢、麻木為該方的使用要點，這正與糖尿病周圍神經(jīng)病變的常見表現(xiàn)相類似，都反映了營衛(wèi)氣血不足、風寒閉阻經(jīng)絡這一核心病機，因此針對這一核心病機的黃芪桂枝五物湯可作為臨床治療DPN的基本方。本次實驗觀察到，彌可保組較模型組大鼠神經(jīng)傳導速度和NGF表達差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，說明彌可保對實驗性糖尿病鼠周圍神經(jīng)損害有一定的防治作用，這與以往文獻報道一致［13］。但我們同時觀察到，黃芪桂枝五物湯高、中、低劑量組亦有效提高糖尿病大鼠神經(jīng)傳導速度，并上調NGF的表達，與模型組和彌可保組比較，差異皆有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或0.01)，顯示黃芪桂枝五物湯對糖尿病大鼠周圍神經(jīng)功能有明顯改善作用，其作用與劑量成正比，上調NGF的表達可能是其作用機制之一。

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