種植合金CPTi和Ti-6Al-4V對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響及在細(xì)胞培養(yǎng)液中腐蝕情況分析

李晶，史玲玲，艾紅軍，徐堅(jiān)，孫偉，鐘鳴

（1.遼寧省口腔醫(yī)學(xué)研究所，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)學(xué)院修復(fù)科，沈陽 110002；2.中國(guó)科學(xué)院沈陽金屬研究所非晶合金組，沈陽110016；3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110002）

目前CPTi和Ti-6Al-4V是臨床上應(yīng)用最廣泛的牙科種植體材料，CPTi屬于惰性金屬，在體液中的耐腐蝕性高，長(zhǎng)期使用后會(huì)在種植體周圍有鈦（Ti）離子析出，但是對(duì)人體無致敏性［1］；不會(huì)引起局部或者全身反應(yīng)［2］，因而CPTi已經(jīng)被視為齒科種植體的金標(biāo)準(zhǔn)材料。但是鈦合金卻是臨床上應(yīng)用最多的齒科植入合金，因?yàn)門i-6Al-4V比CPTi具有更好的機(jī)械性能。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)這兩種材料的生物相容性的評(píng)價(jià)存在很大分歧.一部分學(xué)者認(rèn)為這兩種材料植入體內(nèi)后并無差異，如Espoeito等［3］在分析了多例失敗種植體的表面形態(tài)、成分和氧化物厚度后發(fā)現(xiàn)，無論是早期還是晚期失敗的種植體，其種植后表面氧化物的成分和厚度均未發(fā)生明顯的變化，也未發(fā)現(xiàn)引起種植體失敗與材料有關(guān)的因素；另一部分則認(rèn)為CPTi要明顯優(yōu)于Ti-6Al-4V，在鈦合金的組成元素中，Steinemann已經(jīng)將Cu和V明確列為有毒元素，同時(shí)Ti-6Al-4V的耐腐蝕性能差，已有學(xué)者報(bào)道長(zhǎng)期的體液腐蝕會(huì)導(dǎo)致Al、V等金屬離子的析出［4］，有研究證實(shí)，Ti-6Al-4V析出的金屬離子雖然不會(huì)對(duì)人體器官產(chǎn)生明顯的影響，但卻具有潛在的生物毒性風(fēng)險(xiǎn)［5］。

3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）法是公認(rèn)的、經(jīng)典的評(píng)價(jià)材料細(xì)胞毒性的體外實(shí)驗(yàn)方法［6］，本研究選用了MTT法評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性，還創(chuàng)新性地選用了人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HU） 進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)同步X射線光電子能譜分析（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）分析了細(xì)胞培養(yǎng)液浸泡前后合金表面組元狀態(tài)的變化，旨在檢測(cè)CPTi和Ti-6Al-4V對(duì)HU增殖的影響及CPTi和Ti-6Al-4V是否發(fā)生腐蝕或金屬離子溶解現(xiàn)象。

1 材料與方法

1.1 金屬試件的制備

將CPTi和Ti-6Al-4V制作成直徑6 mm、厚度2 mm的金屬圓片（剛好放入96孔板的孔中），機(jī)械研磨后拋光，依次在丙酮、酒精和去離子水中超聲清洗、吹干，超凈工作臺(tái)中紫外線雙面照射各1h，備用。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HU（ATCC：CRL-1730）培養(yǎng)基選用高糖 DMEM（Gibieo）和10%胎牛血清（天津TBD公司），2～3 d換液，細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)進(jìn)行傳代。

1.3 電鏡觀察

將CPTi和Ti-6Al-4V金屬試件放入96孔板的孔中，傳代后的HU（2×104/mL）接種于96孔板內(nèi)，每種金屬每個(gè)時(shí)間點(diǎn)接種5孔，接種6 h后取出，然后固定，梯度乙醇脫水，樣本噴金，掃描電鏡下拍照。

1.4 MTT法檢測(cè)

將CPTi和Ti-6Al-4V金屬試件放入2塊無菌96孔板中，接種方法同1.3。每種金屬每個(gè)時(shí)間點(diǎn)接種8孔，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組8孔，即不放金屬試件的情況下接種細(xì)胞。設(shè)7個(gè)時(shí)間點(diǎn)：接種后4 h、1 d、2 d、3 d、7 d、10 d和14 d將孔內(nèi)金屬試件移入新的96孔板中，每孔加入MTT（Amresco）溶液，放入培養(yǎng)箱孵育4 h后，取出，避光條件下加入二甲亞楓（Amresco）100 μL，570 nm 波長(zhǎng)條件下酶標(biāo)儀檢測(cè)光密度（optical density，OD）值。

1.5 XPS分析

使用ESCALAB250 X-光線電子能譜儀（美國(guó)Thermo VG公司）對(duì)拋光后以及細(xì)胞培養(yǎng)液浸泡7 d后的金屬片進(jìn)行表面成分深度分析，獲得的全譜和精細(xì)譜，參照C 1 s峰位（284.6 eV）進(jìn)行校正，使用XPSPEAK表面化學(xué)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用SPSS 13.0軟件，數(shù)據(jù)用±s表示，采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 電鏡觀察結(jié)果

如圖1所示，HU接種到CPTi和Ti-6Al-4V 6 h后500倍電鏡下觀察到細(xì)胞呈現(xiàn)卵圓形，在材料表面自由鋪展，2種材料細(xì)胞的數(shù)量、大小和形態(tài)基本沒有差別（圖1A，1B）；5 000倍電鏡下，觀察到細(xì)胞呈攤開的“雞蛋餅”狀，在材料上自由鋪展，向四周伸出很多偽足，細(xì)胞表面分泌很多球蛋白使細(xì)胞表面凹凸不平（圖1C，1D）；10 000倍電鏡下觀察到細(xì)胞的絲狀偽足非常清晰，其上附掛有許多球蛋白，相鄰細(xì)胞間通過偽足緊密接觸（圖1E，1F）。

2.2 MTT結(jié)果

如表1所示，接種后HU數(shù)量隨時(shí)間延長(zhǎng)先是逐漸增多，在3 d時(shí)達(dá)到飽和之后降低。4 h、1 d和3 d時(shí)，CPTi、Ti-6Al-4V材料和對(duì)照組所測(cè)的OD值沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；而 2 d、7 d、10 d 和 14 d時(shí)CPTi和Ti-6AL-4V材料所測(cè)的OD值沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），但都顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。

表1 3組材料接種后HU細(xì)胞數(shù)量MTT結(jié)果比較（±s）Tab.1 MTT results of 3 types of material after inoculation（±s）

表1 3組材料接種后HU細(xì)胞數(shù)量MTT結(jié)果比較（±s）Tab.1 MTT results of 3 types of material after inoculation（±s）

1）P<0.05 vs control group.

OD value 4 h 1 d 2 d 3 d 7 d 10 d 14 d CPTi 0.067±0.03 0.120±0.03 0.232±0.051） 0.731±0.03 0.223±0.031） 0.240±0.071） 0.185±0.031）Ti-6-Al-4V 0.090±0.01 0.139±0.02 0.226±0.031） 0.705±0.04 0.321±0.031） 0.246±0.021） 0.161±0.031）Control 0.078±0.02 0.166±0.01 0.404±0.08 0.660±0.05 0.725±0.03 0.487±0.09 0.277±0.04 Group

2.3 XPS結(jié)果

如圖2所示，CPTi在拋光后以及細(xì)胞培養(yǎng)液中浸泡7 d后表面層Ti、O組元的XPS分析可以發(fā)現(xiàn)隨著濺射深度的增加，Ti元素含量逐漸由16 at.%增加至穩(wěn)定，氧元素含量逐漸降低，氧元素的深度分布可以反映表面腐蝕氧化層的厚度，鈍化膜厚度約為20 nm。隨著濺射深度的變化，鈦元素的價(jià)態(tài)發(fā)生改變，表面層富集氧化態(tài)Ti4+，然后峰位偏移至Ti3+價(jià)態(tài)，緊接著是Ti2+，最終金屬態(tài)Ti0含量逐漸增加趨于穩(wěn)定。隨著濺射深度的增加，鈦元素含量由14 at.%逐漸增加至穩(wěn)定，氧元素含量由77 at.%逐漸降低，鈍化膜厚度增加至45 nm?？梢园l(fā)現(xiàn)相比于浸泡前的拋光樣品，浸泡后表面層聚集更多的氧化態(tài)Ti4+。

Ti-6Al-4V合金片在拋光后以及在細(xì)胞培養(yǎng)液中浸泡7 d后經(jīng)過XPS分析發(fā)現(xiàn)，隨著濺射深度的增加，Ti、Al、V元素含量逐漸增加至穩(wěn)定，氧元素含量逐漸降低，鈍化膜厚度約為18 nm。對(duì)拋光后樣品在不同濺射深度處獲得的Ti 2p、Al 2p、V 2p的XPS精細(xì)譜進(jìn)行分峰擬合后的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其表面主要由氧化態(tài)Ti4+、Al3+以及少量V5+組成，隨著濺射深度增加，金屬態(tài)Ti0，Al0，V0出現(xiàn)，含量逐漸趨于穩(wěn)定。在細(xì)胞培養(yǎng)液中浸泡7 d后表面成分Ti、Al、V、O組元的鈍化膜厚度增加至49 nm左右。在不同濺射深度處獲得的Ti 2p、Al 2p、V 2p的XPS精細(xì)譜進(jìn)行分峰擬合后的結(jié)果可以看出最外表面處主要由氧化態(tài)Ti4+，Al3+和少量V5+組成，隨著濺射深度的增加，金屬態(tài)Ti0，Al0，V0出現(xiàn)并且逐漸達(dá)到穩(wěn)定。與原始拋光后樣品相比，最外表面處富集更多的氧化態(tài)Ti4+和Al3+，說明Ti和Al元素優(yōu)先發(fā)生氧化以增厚鈍化膜從而保護(hù)合金基體。見圖3。

3 討論

生物材料的表面特性對(duì)其植入效果十分重要。生物材料植入體內(nèi)后，首先是通過表面與體內(nèi)環(huán)境（包括體液、細(xì)胞和組織）接觸，因此生物材料表面特性對(duì)其抗腐蝕性、早期植入效果、生物活性以及血液相容性等都有直接影響。對(duì)生物材料表面結(jié)構(gòu)與組成進(jìn)行深入分析有助于了解它們對(duì)植入體的影響及其作用過程，并為生物材料的表面改性提供理論指導(dǎo)。拋光后CPTi和Ti-6Al-4V合金初始表面膜主要由氧化態(tài)Ti4+組成，Ti-6Al-4V合金表面還含有少量氧化態(tài)Al3+和微量V5+，表面鈍化膜厚度為20 nm左右。細(xì)胞培養(yǎng)液浸泡后，表面膜的生成和合金元素的溶解過程同時(shí)發(fā)生，最終表面膜增厚以保護(hù)基體金屬。本實(shí)驗(yàn)中XPS分析浸泡14 d后的CPTi和Ti-6Al-4V表面均有不同厚度的氧化膜生成，可以有效阻止金屬離子的析出，因此認(rèn)為這兩種種植體合金材料的耐腐蝕性能幾乎沒有差別，都非常好。但是種植體植入體內(nèi)后組織液中氧的濃度比空氣中差很多，因此氧化膜的厚度可能會(huì)減小，同時(shí)形成的時(shí)間會(huì)比較長(zhǎng)。另外，本研究中使用的是細(xì)胞培養(yǎng)液，與真正植入體內(nèi)后的骨組織中的組織液的浸泡還是有差別的，進(jìn)一步的檢測(cè)還需要?jiǎng)游飳?shí)驗(yàn)來進(jìn)行驗(yàn)證。

Turpin等［7］發(fā)現(xiàn)浸泡前鈦金屬表面的氧化膜厚度約為30 nm，在酸性口腔液中浸泡后表面鈍化膜厚度有了明顯提高，主要是由鈦的各種氧化狀態(tài)組成，這與本結(jié)果接近。本研究使用的浸泡環(huán)境是高糖DMEM（加10%胎牛血清）中含有各種無機(jī)鹽離子（如 Cl-、PO43-）和有機(jī)物（如氨基酸和蛋白質(zhì)）。蛋白質(zhì)是一種球形的細(xì)胞外白蛋白，可與大多數(shù)固體表面發(fā)生強(qiáng)相互作用，金屬表面吸附蛋白質(zhì)分子后，一方面阻礙Cl-離子侵蝕，另一方面也阻止氧在金屬表面的擴(kuò)散，影響鈍化膜的形成。同時(shí)，蛋白質(zhì)可以與金屬離子絡(luò)合，加速金屬離子的溶解，這3個(gè)方面相互制約導(dǎo)致金屬表面保護(hù)膜的形成與表面金屬離子溶解間的平衡。有文獻(xiàn)報(bào)道［8］在模擬體液中CPTi和Ti-6Al-4V合金均具有較好的耐蝕能力。

現(xiàn)有評(píng)價(jià)牙科合金細(xì)胞毒性的研究多數(shù)選擇的細(xì)胞分為兩種：（1）大鼠成纖維細(xì)胞（L929）［9］，這是ISO國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)中指定的用于檢測(cè)材料毒性的細(xì)胞；（2）與種植體表面直接接觸的成骨細(xì)胞。目前使用的大多是小鼠成骨細(xì)胞（MC3T3）［10］和人骨肉瘤樣細(xì)胞（MG-63）［11］。但是，還有一類細(xì)胞與種植體的頸部有小面積的直接接觸，即人的牙齦上皮細(xì)胞，除此以外，還可以選用上皮細(xì)胞來研究種植體的細(xì)胞毒性。我們選用的HU在炎性反應(yīng)中有著重要的作用，它可以分泌相關(guān)的細(xì)胞因子，表達(dá)與材料表面相互作用的黏附分子［12］，可以幫助我們從炎癥的角度來認(rèn)識(shí)細(xì)胞與植入材料的相互作用。

綜上所述，本研究認(rèn)為CPTi和Ti-6Al-4V的生物相容性沒有差別。Takemoto等［13］對(duì)CPTi和幾種新型鈦合金進(jìn)行了細(xì)胞毒性的評(píng)估，將它們接種在3T3細(xì)胞上72 h，MTT結(jié)果未檢測(cè)到明顯的差異。因此認(rèn)為，鈦合金在生物環(huán)境中可能存在低腐蝕，數(shù)量極少的金屬離子不足以引起明顯的毒性，而本研究中將細(xì)胞接種的最長(zhǎng)時(shí)間延至14 d，細(xì)胞的增殖過程中已經(jīng)出現(xiàn)了一個(gè)峰值，然后逐漸降低，所得到的MTT結(jié)果仍顯示2種材料沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，同步的XPS結(jié)果觀察到CPTi和Ti-6Al-4V都有鈍化膜形成，也沒有看到點(diǎn)蝕情況的發(fā)生，這在一定程度上可以說明生長(zhǎng)在材料表面的細(xì)胞的代謝活動(dòng)對(duì)材料幾乎沒有腐蝕作用。但是人們對(duì)Ti-6Al-4V的離子釋放問題始終很擔(dān)憂，因此長(zhǎng)期的腐蝕效果觀察還需要進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

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