耐藥性木霉T2菌株的篩選、紫外誘變與藥劑馴化

尹婷，徐秉良，梁巧蘭，古麗君，李榮峰

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室中－美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州730070）

木霉（Trichodermaspp.）作為一類重要的生防真菌，廣泛存在于土壤、空氣和植物體表面等生態(tài)環(huán)境中［1］，具有適應(yīng)性強(qiáng)，存在范圍廣和廣譜、高效等優(yōu)點(diǎn)。但目前單獨(dú)使用生防因子來(lái)控制作物病害，往往受到環(huán)境條件等因素的干擾，造成田間防治效果不穩(wěn)定［2］，因此生產(chǎn)上常與殺菌劑混合使用，然而，木霉菌對(duì)化學(xué)藥劑較為敏感，限制了其使用范圍和防治效果。因此，深入研究、開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)優(yōu)良木霉菌及進(jìn)行木霉菌株的耐藥性研究，對(duì)防治植物真菌病害，促進(jìn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要意義。近年來(lái)，殺菌劑，特別是高效、內(nèi)吸、專一性殺菌劑得到了廣泛應(yīng)用［3］，雖然化學(xué)農(nóng)藥見(jiàn)效快，防效高，但是它的長(zhǎng)期使用會(huì)給人類健康帶來(lái)嚴(yán)重隱患，并且造成生態(tài)環(huán)境失衡，引發(fā)有害生物產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致其他有益生物數(shù)量下降、人畜中毒，不利于綠色植保事業(yè)的發(fā)展［4，5］。隨著人類對(duì)生態(tài)環(huán)境及綠色食品的重視，促使人們開(kāi)展多方面研究以開(kāi)發(fā)高效、低毒、低殘留及與環(huán)境和諧的生態(tài)合理農(nóng)藥［6］。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)抗真菌藥物耐藥機(jī)制的研究和抗真菌藥物的耐藥性研究取得了一定的進(jìn)展，有關(guān)木霉耐藥性的報(bào)道也越來(lái)越多。王勇等［2］通過(guò)含藥培養(yǎng)基的篩選，得到了速克靈抗性拮抗木霉菌株，二者協(xié)同使用比單獨(dú)使用可以更好地防治灰霉病，并研究了最佳配比。為了獲得優(yōu)良的耐藥性木霉菌株，需要對(duì)野生菌株加以改良。目前的菌株改良手段主要有誘變育種、原生質(zhì)體融合和遺傳改造［7－9］。但直到20世紀(jì)80年代，誘變育種技術(shù)才真正用于木霉研究［10］，其中，紫外線誘導(dǎo)是一種簡(jiǎn)便、實(shí)用、應(yīng)用廣泛的菌種改良方法。丁中等［11］通過(guò)紫外光照射結(jié)合使用含藥培養(yǎng)基培養(yǎng)得到了3個(gè)哈茨木霉腐霉利抗性突變菌株，抗性菌株與親本菌株相比較，其抗藥性提高100倍以上。魯海菊等［12］用紫外誘變哈茨木霉，通過(guò)多菌靈耐藥性篩選，獲得耐藥性菌株，為進(jìn)一步篩選強(qiáng)根際能力木霉菌株提供了優(yōu)質(zhì)材料。田連生等［13］也篩選出對(duì)化學(xué)殺菌劑腐霉利（商品名稱速克靈）有顯著抗性的突變性霉菌株UT－4。本研究擬通過(guò)耐藥性測(cè)定和紫外光誘變及藥劑馴化培養(yǎng)，以期篩選出能夠與殺菌劑混合的木霉菌株。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

深綠木霉（T.aureoviride）T2菌株和灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 供試藥劑

供試藥劑6種，分別是75%百菌清可濕性粉劑（上海亞泰農(nóng)資有限公司生產(chǎn)）、80%多菌靈可濕性粉劑（河北益海安格諾農(nóng)化有限公司生產(chǎn)）、15%三唑酮可濕性粉劑（江蘇劍牌農(nóng)藥化工有限公司生產(chǎn)）、65%代森錳鋅可濕性粉劑（成都皇牌作物科學(xué)有限公司生產(chǎn)）、50%速克靈可濕性粉劑（甘肅農(nóng)科院植保所新農(nóng)藥開(kāi)發(fā)中心生產(chǎn)）和50%撲海因可濕性粉劑（拜耳作物科學(xué)公司生產(chǎn)）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 耐藥性測(cè)定 試驗(yàn)于2010年7月實(shí)施，重復(fù)進(jìn)行3次。采用含毒介質(zhì)培養(yǎng)方法［14］。稱取各供試藥劑，加無(wú)菌水，配成濃度分別為2.5，5.0，10.0，20.0，40.0mg／mL的母液。PDA 培養(yǎng)基（每三角瓶49mL）冷卻到50℃左右時(shí)，分別加入1mL上述濃度的母液，使含藥培養(yǎng)基的最終含藥濃度分別達(dá)到50，100，200，400，800 μg／mL，充分搖勻后，均勻倒入3個(gè)培養(yǎng)皿中制成平板。再用打孔器切取直徑為6mm的深綠木霉T2菌塊，移植于含藥平板中央，每處理重復(fù)3次。將各處理置于25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)60h，測(cè)量菌落直徑。以加入等量無(wú)菌水制成的PDA平板為對(duì)照。用如下公式計(jì)算抑菌率：

以藥劑有效成分濃度對(duì)數(shù)值為自變量（x），相對(duì)抑制率的機(jī)率值為因變量（y），計(jì)算出毒力回歸方程式和相關(guān)系數(shù)。由毒力回歸方程，令y＝5（即抑制50%的機(jī)率值），反常用對(duì)數(shù)x即為EC50值。

1.3.2 紫外光誘導(dǎo) 在深綠木霉T2菌株培養(yǎng)物上用直徑6mm的打孔器打孔，將菌餅接到PDA平板培養(yǎng)基上，在25℃下恒溫培養(yǎng)7d，加無(wú)菌水用無(wú)菌毛筆輕輕洗刷，用無(wú)菌紗布過(guò)濾除去菌絲得孢子懸浮液。用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定孢子濃度，使其達(dá)到1×108個(gè)孢子／mL。將此懸浮液0.1mL，均勻涂布于PDA平板上［10］，置于超凈工作臺(tái)上10W紫外燈管下60cm處（不加蓋），用黑布遮住超凈工作臺(tái)，避開(kāi)外界光進(jìn)行照射。設(shè)0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0h共6個(gè)照射時(shí)間處理。處理后立即用黑紙把平板包好，并放入25℃的恒溫箱中黑暗培養(yǎng)［15］，5d后統(tǒng)計(jì)平板上生長(zhǎng)菌落數(shù)。以不經(jīng)過(guò)紫外光照射的PDA平板為對(duì)照。

1.3.3 藥劑馴化 將以上培養(yǎng)5d后在PDA平板上生長(zhǎng)的菌落打孔，取直徑6mm菌餅轉(zhuǎn)移到含速克靈濃度為50μg／mL的含藥平板上培養(yǎng)。5d后選取生長(zhǎng)最快菌落，在邊緣打孔，取直徑6mm菌餅接種在速克靈濃度為100μg／mL的含藥平板上，在25℃恒溫培養(yǎng)。5d后再次選擇生長(zhǎng)最快的菌落，取直徑6mm的菌餅接種在速克靈濃度為200μg／mL的PDA平板上［16］。用此方法，將在速克靈濃度400和800μg／mL上測(cè)試，最終選擇出生長(zhǎng)最快的菌落。

1.3.4 抗藥穩(wěn)定性測(cè)定 將篩選出的抗藥性木霉菌株分別接種在PDA平板上，于25℃恒溫培養(yǎng)，每7d轉(zhuǎn)接1次，連續(xù)轉(zhuǎn)接10次［17］。再在速克靈濃度為800μg／mL的PDA平板上培養(yǎng)，測(cè)量60h時(shí)菌落直徑，以原始菌株為對(duì)照，計(jì)算速克靈對(duì)選出菌株的生長(zhǎng)抑制率。每處理重復(fù)3次。

1.3.5 生長(zhǎng)速率及產(chǎn)孢能力測(cè)定 將各抗藥性木霉菌株取直徑6mm的菌塊接種于PDA平板上，在25℃下恒溫培養(yǎng)，每天測(cè)量菌落直徑1次，連續(xù)測(cè)量3d，計(jì)算各抗藥性木霉菌株的生長(zhǎng)速率；培養(yǎng)7d后取10mL無(wú)菌水沖洗培養(yǎng)物表面，得到孢子懸浮液。取該懸浮液1mL加入盛有99mL無(wú)菌水的三角瓶中，在轉(zhuǎn)速為200r／min的搖床上振蕩20min，使孢子在無(wú)菌水中分散均勻，用血球計(jì)數(shù)板測(cè)產(chǎn)孢濃度［17］。以上每處理均為3次重復(fù)。

1.3.6 對(duì)灰葡萄孢菌的拮抗作用測(cè)定 將木霉親本菌株和各抗藥性菌株分別與灰葡萄孢菌對(duì)峙接種于PDA平板，菌塊直徑6mm，兩接菌點(diǎn)相距40mm。同時(shí)，單獨(dú)接種木霉菌灰葡萄孢菌做對(duì)照。每處理重復(fù)3次，于25℃下培養(yǎng)，并測(cè)量對(duì)照灰葡萄孢菌直徑和灰葡萄孢菌菌落中心到木霉菌菌落邊緣的距離，計(jì)算各木霉菌株對(duì)灰葡萄孢菌的抑菌率，統(tǒng)計(jì)拮抗系數(shù)，并篩選出拮抗性最強(qiáng)的菌株。

計(jì)算抑菌率采用以下公式：I＝100－（R2／R1）×100%［18］。式中，I為木霉菌的抑菌率，R1為對(duì)照灰葡萄孢菌直徑，R2為灰葡萄孢菌菌落中心到木霉菌菌落邊緣的距離。

拮抗系數(shù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（5級(jí)）［19］：Ⅰ級(jí)：深綠木霉菌絲面積≥100%平皿面積；Ⅱ級(jí)：深綠木霉菌絲面積≥67%平皿面積；Ⅲ級(jí)：33%平皿面積＜深綠木霉菌絲面積＜67%平皿面積；Ⅳ級(jí)：深綠木霉菌絲面積≤33%平皿面積；Ⅴ級(jí)：病原菌菌絲面積≥100%平皿面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐藥性測(cè)定

深綠木霉T2菌株在含不同殺菌劑的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況詳見(jiàn)表1。深綠木霉T2菌株對(duì)不同殺菌劑耐藥性不同，殺菌劑對(duì)木霉菌的抑制作用隨藥劑施用濃度的增大而逐漸增強(qiáng)。接種培養(yǎng)60h后發(fā)現(xiàn)，深綠木霉T2菌株對(duì)百菌清、多菌靈、三唑酮、代森錳鋅、速克靈和撲海因的耐藥性順序由強(qiáng)到弱分別是代森錳鋅、三唑酮、百菌清、多菌靈、撲海因、速克靈，EC50分別為221.14，171.12，150.90，123.24，42.12和26.24μg／mL。

2.2 紫外光誘變選育

紫外光處理對(duì)木霉分生孢子有一定的致死作用，但不同照射時(shí)間均能有一定數(shù)量的孢子存活。其中照射0.5 h平板上產(chǎn)生的菌落數(shù)最多，共產(chǎn)生5個(gè)；照射3.0h平板上產(chǎn)生的菌落數(shù)最少，共產(chǎn)生2個(gè)；照射1.0和1.5h平板上產(chǎn)生的菌落數(shù)均為4個(gè)；照射2.0和2.5h平板上產(chǎn)生的菌落數(shù)均為3個(gè)。

表1 深綠木霉T2菌株對(duì)6種殺菌劑的耐藥性測(cè)定Table 1 Endurance of T.aureoviride T2against 6kinds of fungicides

2.3 藥劑馴化培養(yǎng)

將上述紫外光誘導(dǎo)得到6株突變型菌株，分別標(biāo)記為T2－1～T2－6。根據(jù)測(cè)量的各菌落直徑，計(jì)算生長(zhǎng)抑制率。結(jié)果表明，親本菌株T2在含速克靈的培養(yǎng)基上基本不生長(zhǎng)，其受抑制率為91.58%，而6個(gè)突變型菌株分別為20.75%，24.83%，15.76%和12.41%。其中T2－6受速克靈的影響很小。速克靈對(duì)其他突變型菌株 T2－3、T2－4的抑制率較高，分別達(dá)到62.34%和70.18%。因此篩選出4株對(duì)速克靈抗性較好的突變型菌株T2－1、T2－2、T2－5和 T2－6。

2.4 抗藥穩(wěn)定性

將上述篩選出的抗藥性木霉菌株T2－1、T2－2、T2－5和T2－6連續(xù)10次轉(zhuǎn)接后發(fā)現(xiàn)，速克靈對(duì)各抗藥性木霉菌株生長(zhǎng)抑制率的變化都不是很大，表明突變菌株的抗藥性沒(méi)有隨著傳代培養(yǎng)而消失。其中T2－6菌株的抗藥特性更加穩(wěn)定，基本未發(fā)生變化（表2）。

表2 速克靈對(duì)轉(zhuǎn)接后各抗藥性木霉菌株的生長(zhǎng)抑制率測(cè)定Table 2 Growth inhibition rate of Procymidone on each antagonistic Trichodermastrains after inoculation %

2.5 生長(zhǎng)速率和產(chǎn)孢能力

從菌絲的生長(zhǎng)速率來(lái)看，T2－6菌株的平均生長(zhǎng)速率最快，明顯高于親本菌株T2和其他3個(gè)抗藥菌株，T2－5菌株與親本菌株接近，T2－1和T2－2菌株均低于親本菌株；在產(chǎn)孢量上，T2－6菌株的產(chǎn)孢量同樣明顯高于親本菌株T2和其他3個(gè)抗性菌株，親本菌株的產(chǎn)孢量高于其他3個(gè)抗藥菌株（表3）。

表3 抗藥性木霉菌株的生長(zhǎng)速率和產(chǎn)孢能力Table 3 Growth rate and ability of producing spores of antagonistic Trichodermastrains

2.6 抗性木霉菌株對(duì)灰葡萄孢菌的拮抗作用

各抗性菌株和親本菌株對(duì)灰葡萄孢菌都有強(qiáng)烈的拮抗作用。各個(gè)木霉菌株和灰葡萄孢菌先在平板兩邊各自生長(zhǎng)，48h后兩菌落邊緣接觸，木霉菌對(duì)灰葡萄孢菌產(chǎn)生抑制作用，使其生長(zhǎng)速率減緩直至停止?？剐跃闠2－6對(duì)灰葡萄孢菌的抑制率最高，達(dá)到93.26%，T2－5菌株和親本菌株抑制率相近，僅相差1.31%，T2－2菌株對(duì)灰葡萄孢菌的抑制率最低，為82.75%（圖1）。T2－1、T2－2菌株對(duì)灰葡萄孢菌的平菌抑菌率與親本菌株的抑菌率差異顯著，T2－5和T2－6菌株對(duì)灰葡萄孢菌的抑菌率差異不顯著，T2－1、T2－2和T2－5菌株對(duì)灰葡萄孢菌的抑菌率差異不顯著，T2－6菌株與T2－1、T2－2菌株對(duì)灰葡萄孢菌的抑菌率差異顯著?？剐跃闠2－5、T2－6和親本菌株的拮抗系數(shù)均為Ⅱ，T2－1和T2－2菌株的拮抗系數(shù)為Ⅳ。通過(guò)對(duì)以上試驗(yàn)結(jié)果的綜合分析，最后篩選出突變型木霉菌株T2－6為最佳抗藥性菌株（表4）。

3 討論與結(jié)論

6種殺菌劑對(duì)深綠木霉的生長(zhǎng)均有一定的抑制作用，且隨著藥劑濃度的增加，抑制作用越明顯；不同的藥劑對(duì)木霉的抑制力不同，其中代森錳鋅的抑制力最低，速克靈的抑制力最高；通過(guò)對(duì)深綠木霉T2菌株的紫外線誘變處理和含藥平板馴化培養(yǎng)，成功篩選出了對(duì)速克靈產(chǎn)生高度抗性的突變型菌株。紫外線作為一種物理誘變因子，具有誘變效果明顯和方法簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，是誘導(dǎo)微生物突變的一種非常有用的工具，通過(guò)擴(kuò)大突變體的篩選基數(shù)，可得到性能優(yōu)良的變異菌株［20］。Papvizas［21，22］以苯菌靈為敏感性標(biāo)記物，采用紫外線誘變對(duì)哈茨木霉（T.harzianum）和綠色木霉（T.viride）進(jìn)行誘變，得到了對(duì)苯菌靈有耐藥性的菌株，這些變異菌株的生長(zhǎng)特性，產(chǎn)孢量以及抗菌能力同親本菌株相比都有顯著改善。楊合同等［10］通過(guò)紫外線誘變處理，獲得了對(duì)多菌靈具有抗性的突變菌株，該突變株在PDA培養(yǎng)基上連續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)20代后，其抗藥性、生長(zhǎng)速度都沒(méi)有改變，表現(xiàn)非常穩(wěn)定。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)深綠木霉菌株T2－6，該突變型菌株的生長(zhǎng)速率、產(chǎn)孢量以及拮抗作用與親本菌株相近，而抗藥性卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于親本菌株，連續(xù)轉(zhuǎn)接10代，其抗藥性隨傳代仍然表現(xiàn)穩(wěn)定。

木霉菌適應(yīng)環(huán)境的一個(gè)重要方面就是對(duì)化學(xué)農(nóng)藥的抗性，解決了這個(gè)問(wèn)題，才能保證木霉菌在生防中發(fā)揮更好的作用，能夠最大限度地發(fā)揮生物農(nóng)藥的作用，減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，提高木霉菌制劑對(duì)作物病害的防治效果［23，24］。

由于木霉菌在PDA平板的培養(yǎng)是無(wú)性繁殖，這種由微效多基因控制的抗性似能穩(wěn)定遺傳［18］，這在本試驗(yàn)中也得到了證明。但是木霉菌在自然條件下存在準(zhǔn)性生殖，其抗藥性是否能夠穩(wěn)定遺傳，還需進(jìn)一步證明。同時(shí)生防制劑的應(yīng)用還受到溫度、濕度、光照等各種因素的影響，獲得的抗性菌株與速克靈如何混合、混合使用后的田間防治效果等問(wèn)題本試驗(yàn)尚未涉及，還有待進(jìn)一步的研究。

表4 抗藥性木霉菌株對(duì)灰葡萄孢菌的拮抗作用Table 4 Antagonism of antagonistic Trichoderma strains to Botrytis cinerea

圖1 抗藥性木霉菌株對(duì)灰葡萄孢菌的拮抗作用Fig.1 Antagonism of antagonistic Trichoderma strains to Botrytis cinerea

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