紅三葉異黃酮對(duì)低溫誘發(fā)肉雞腹水綜合癥發(fā)生和抗氧化性能的影響

姜義寶，楊玉榮，馮長(zhǎng)松，王成章，崔國(guó)文

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州450002；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150030）

肉雞腹水綜合癥（ascites syndrome，AS）又稱肉雞肺動(dòng)脈高壓綜合癥（pulmonary hypertension syndrome，PHS），是一種由多種致病因子引起的非傳染性疾病，以右心肥大－腹水形成為特征的主要發(fā)生于商品代肉仔雞的一種綜合癥侯群。近年來(lái)該病的發(fā)生率呈上升趨勢(shì)，成為困擾肉雞養(yǎng)殖業(yè)的嚴(yán)重疾病之一，造成巨大的損失。肉雞AS的原發(fā)性因素是缺氧性肺動(dòng)脈高壓，一些學(xué)者研究認(rèn)為自由基的介導(dǎo)機(jī)制可能是肉雞AS發(fā)生的病因。快速生長(zhǎng)的肉雞對(duì)氧的大量需要，機(jī)體供氧不足導(dǎo)致組織細(xì)胞產(chǎn)生大量的氧自由基，消耗體內(nèi)的抗氧化物質(zhì)，引起AS患雞體內(nèi)抗氧化防御體系功能降低，使生物膜脂質(zhì)過(guò)氧化和DNA變異，將損傷細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，缺氧條件下自由基促發(fā)血管收縮、重構(gòu)和血栓形成，肺動(dòng)脈壓升高，導(dǎo)致AS的發(fā)生［1，2］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明，氧自由基的增多以及清除自由基的物質(zhì)減少或活性降低，在肺動(dòng)脈高壓等血管性疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用［3］。肉雞飼養(yǎng)過(guò)程中添加抗氧劑，能夠減輕自由基對(duì)機(jī)體的損傷，有效的預(yù)防和治療AS。補(bǔ)硒和添加Ve可明顯地減緩脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，降低AS的死亡率［4］。齊永華和王文魁［5］在飲水中添加中藥口服液，發(fā)現(xiàn)能明顯降低冷刺激條件下肉雞心肌組織的損傷，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，提高機(jī)體抗冷應(yīng)激和耐缺氧能力，明顯降低AS的發(fā)生。

紅三葉（Trifolium pratense）為豆科三葉草屬的多年生草本植物，南北均有種植，資源豐富，是集草、藥兼用于一體的優(yōu)良植物，具有廣闊的應(yīng)用和開(kāi)發(fā)價(jià)值［6］。紅三葉異黃酮是紅三葉草中重要活性物質(zhì)，屬于4′－甲氧基類異黃酮，主要含有4種異黃酮，即芒柄花素（Formononetin）、鷹嘴豆芽素A（Biochanin A）、大豆黃素（Daidzein）、染料木素（Genistein）［7］。流行病學(xué)研究表明，紅三葉異黃酮具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡等作用［8，9］，適量應(yīng)用可以降低心血管疾病的發(fā)生概率，其中抗氧化和抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡備受關(guān)注。紅三葉異黃酮對(duì)血紅蛋白－過(guò)氧化氫、黃嘌呤氧化酶誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)有明顯抑制作用，還能保護(hù)大腦神經(jīng)元細(xì)胞，有效消除紫外線引起的DNA損傷，被認(rèn)為是有效的抗氧化劑和自由基清除劑［10］。紅三葉異黃酮在肉雞上應(yīng)用具有提高其生長(zhǎng)速度、改善肉質(zhì)的作用［11］，但對(duì)AS的影響國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。本研究在肉雞飼料中添加紅三葉異黃酮，分析低溫下對(duì)AS和抗氧化性能的影響，為AS的預(yù)防和治療提供一種新的途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和設(shè)計(jì)

2009年1月購(gòu)買300羽1日齡AA雄性肉仔雞，正常飼養(yǎng)至10日齡，隨機(jī)分成對(duì)照組（Ⅰ）、低溫組（Ⅱ）和低溫黃酮組（Ⅲ），每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15只。Ⅰ組為常溫飼養(yǎng)，溫度在（24±2）℃，Ⅱ和Ⅲ組低溫飼養(yǎng)，溫度為（12±2）℃，Ⅰ和Ⅱ組飼喂基礎(chǔ)日糧，Ⅲ組飼喂基礎(chǔ)日糧＋紅三葉異黃酮（20mg／kg），紅三葉異黃酮購(gòu)于湖南現(xiàn)代九匯有限公司，總黃酮含量80.64%。雞采用籠養(yǎng)，自由采食和飲水，第7天進(jìn)行新城疫和傳支二聯(lián)苗免疫。

1.2 心臟指數(shù)的測(cè)定

分別于14，21，28，35，42日齡每組隨機(jī)取6只雞，取出心臟，清除脂肪組織和心腔內(nèi)瘀血凝塊，沿冠狀溝剪去心房，稱取全心室（TV）重量，再沿前后縱溝剪下右心室（RV）稱重，最后計(jì)算RV質(zhì)量／TV質(zhì)量×100%，此為心臟指數(shù)（ascites heart index，AHI）。

1.3 紅細(xì)胞壓積的測(cè)定

紅細(xì)胞壓積（packed cell volume，PCV）采用溫氏法，用肝素鈉作為抗凝劑，采靜脈血2mL注入試管中，用細(xì)長(zhǎng)的毛細(xì)滴管吸取抗凝血，防止氣泡的產(chǎn)生，緩緩注入溫氏管到刻度100mm處，以3 000r／min的速度離心30 min，讀取紅細(xì)胞層的高度，然后再離心10min至紅細(xì)胞不再下沉為止，此為PCV值。

1.4 各組肉雞PHS發(fā)生率的統(tǒng)計(jì)

肉雞進(jìn)行解剖，在臨床上各器官表現(xiàn)異常，有發(fā)生腹水的肉雞典型特征，其中以肉雞腹腔積液大于10mL為腹水發(fā)生的判定標(biāo)準(zhǔn)之一；并測(cè)定所有肉雞的AHI，AHI＞0.25作為腹水發(fā)生的判定的另一標(biāo)準(zhǔn)，二者同時(shí)具備作為AS最后判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 抗氧化性能的測(cè)定

肉雞采血分離血清，同時(shí)采肝臟組織，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH－Px）和丙二醛（malonaldehyde，MDA）測(cè)定所用的試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，所用的測(cè)定方法均按照操作說(shuō)明進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2003處理數(shù)據(jù)和DPS 7.05軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，以P＜0.01（差異極顯著）或P＜0.05（差異顯著）為顯著性標(biāo)準(zhǔn)，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅三葉異黃酮對(duì)肉雞AHI的影響

肉雞飼喂紅三葉異黃酮能夠減輕AHI，隨著飼養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，Ⅲ組AHI逐漸增大，但低于Ⅱ組（表1）。在第14和22天，Ⅲ組AHI高于Ⅰ組，低于Ⅱ組，各組間差異不顯著（P＞0.05），在第28和35天 Ⅲ組和Ⅰ組均顯著低于Ⅱ組（P＜0.05或0.01），42dⅢ組和Ⅰ組低于Ⅱ組，并且各組間無(wú)明顯差異（P＞0.05）。

2.2 紅三葉異黃酮對(duì)肉雞PCV的影響

肉雞PCV在第14天，各組間無(wú)明顯差異（P＞0.05），在第21和28天Ⅰ組低于Ⅱ組和Ⅲ組，并且顯著低于Ⅱ組（P＜0.05），Ⅲ組低于Ⅱ組但無(wú)明顯差異（P＞0.05），在35d，Ⅲ組和Ⅰ組均極顯著低于Ⅱ組（P＜0.01），在第42天Ⅰ組顯著低于Ⅱ組與Ⅲ組（P＜0.05），表明紅三葉異黃酮能夠降低肉雞PCV（表2）。

表1 紅三葉異黃酮對(duì)肉雞右心肥大指數(shù)的影響Table 1 Effect of red clover isoflavones on ascites heart index（AHI）of broilers

表2 紅三葉異黃酮對(duì)肉雞紅細(xì)胞壓積的影響Table 2 Effect of red clover isoflavones on packed cell volume（PCV）of broilers %

2.3 紅三葉異黃酮對(duì)低溫肉雞AS發(fā)生率的影響

Ⅰ組在試驗(yàn)期間肉雞腹水發(fā)生率為1%，Ⅱ組為15%，Ⅲ組為4%，低溫組AS發(fā)病率分別比Ⅰ組和Ⅱ組高14.00和2.75倍，表明紅三葉異黃酮能夠明顯降低AS的發(fā)生率（表3）。

2.4 紅三葉異黃酮對(duì)肉雞SOD含量的影響

肉雞日糧加入紅三葉異黃酮，血清SOD呈先增高后降低的變化（表4），肉雞生長(zhǎng)第14和21天，Ⅲ組和Ⅰ組血清SOD含量顯著低于Ⅱ組（P＜0.05），28～35dⅢ組和Ⅰ組顯著高于Ⅱ組（P＜0.05或0.01），第42天Ⅰ組顯著高于Ⅱ組（P＜0.05），Ⅲ組高于Ⅱ組但無(wú)明顯差異（P＞0.05）。

肉雞日糧加入紅三葉異黃酮，肝臟SOD呈先增高后降低的變化，第14和21天，Ⅰ肝臟SOD含量顯著低于Ⅱ組（P＜0.05），Ⅲ組低于Ⅱ組，但差異不顯著（P＞0.05），第28和35天Ⅲ組和Ⅰ組顯著高于Ⅱ組（P＜0.05），42dⅢ組和Ⅰ組高于Ⅱ組但無(wú)明顯差異（P＞0.05）。

表3 紅三葉異黃酮對(duì)AS發(fā)生率的影響Table 3 Effect of red clover isoflavones on ascites syndrome incidence of broilers %

表4 紅三葉異黃酮對(duì)肉雞血清和肝臟SOD含量的影響Table 4 Effect of red clover isoflavones on the content of SOD in serum and liver of broilers U／mL

2.5 紅三葉異黃酮對(duì)肉雞GSH－Px含量的影響

肉雞日糧加入紅三葉異黃酮，血清GSH－Px呈逐漸降低的變化（表5），生長(zhǎng)第14天Ⅲ組和Ⅰ組血清GSHPx含量高于Ⅱ組，并且Ⅰ組顯著高于Ⅱ組（P＜0.05），21dⅢ組和Ⅰ組高于Ⅱ組，但無(wú)明顯差異（P＞0.05），28～42dⅢ組和Ⅰ組顯著高于Ⅱ組（P＜0.05或0.01）。

肉雞日糧加入紅三葉異黃酮，肝臟GSH－Px呈逐漸降低的變化，肉雞生長(zhǎng)第14和21天Ⅲ組和Ⅰ組肝臟GSH－Px含量無(wú)明顯差異（P＞0.05），28，35，42dⅢ組和Ⅰ組顯著高于Ⅱ組（P＜0.05或0.01）。

2.6 紅三葉異黃酮對(duì)肉雞MDA含量的影響

肉雞日糧加入紅三葉異黃酮，血清中MDA含量呈增高的變化趨勢(shì)（表6），在肉雞生長(zhǎng)第14和21天，Ⅲ組和Ⅰ組血清MDA含量低于Ⅱ組，并且Ⅰ組顯著低于Ⅱ組（P＜0.05或0.01），28～42dⅢ組和Ⅰ組顯著低于Ⅱ組（P＜0.05或0.01）。

肉雞日糧加入紅三葉異黃酮，肝臟中MDA含量呈增高的變化趨勢(shì)，肉雞生長(zhǎng)第14天，Ⅲ組和Ⅰ組肝臟MDA含量低于Ⅱ組，并且Ⅰ顯著低于Ⅱ組（P＜0.05），21～42dⅢ組和Ⅰ組顯著低于Ⅱ組（P＜0.05或0.01），在35，42dⅢ組MDA含量顯著高于Ⅰ組（P＜0.05），其他組之間無(wú)明顯差異。

表5 紅三葉異黃酮對(duì)肉雞血清和肝臟GSH－Px含量的影響Table 5 Effect of red clover isoflavones on the content of GSH－Px in serum and liver of broilers U／mL

表6 紅三葉異黃酮對(duì)肉雞血清和肝臟MDA含量的影響Table 6 Effect of red clover isoflavones on the content of MDA in serum and liver of broilers nmol／mL

3 討論

低溫條件下肉雞的新陳代謝加強(qiáng)，對(duì)氧的需要量明顯增加，心臟增加肺部的血流量輸出，血流量的增加導(dǎo)致肺部血管網(wǎng)對(duì)血流的阻力增加，形成肺動(dòng)脈高壓，肺動(dòng)脈壓的升高使右心室后負(fù)荷增加，導(dǎo)致右心功能和結(jié)構(gòu)代償，出現(xiàn)右心肥大，導(dǎo)致心衰［12］，最終形成AS。研究表明肉雞AS發(fā)生發(fā)展過(guò)程中血容量增加、紅細(xì)胞變形性降低、血液黏度升高等都與肺動(dòng)脈壓升高密切相關(guān)［13，14］。本試驗(yàn)中加入紅車軸異黃酮，可明顯抑制PCV和AHI，降低環(huán)境低溫下AS發(fā)病率。李曉莉等［15］給慢性缺氧大鼠飼喂染料木黃酮可以預(yù)防右心室肥大發(fā)生，降低AHI。紅三葉異黃酮作為植物雌激素，改善血管的柔順性，調(diào)節(jié)血管細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的合成與釋放，擴(kuò)張血管、增加血管容積改變量，這使得肺動(dòng)脈壓降低，右心負(fù)擔(dān)減輕，防止右心肥大，紅細(xì)胞增生亦受到一定程度的抑制，血液粘稠度降低，減少了環(huán)境低溫下肉雞AS的發(fā)生。缺氧可增加細(xì)胞內(nèi)Ca2＋水平，酪氨酸激酶途徑被激活，植物雌激素為酪氨酸激酶抑制劑，可抑制Ca2＋流入和血管收縮，降低肺動(dòng)脈高壓。

肉雞絕對(duì)缺氧（如高海拔）和相對(duì)缺氧（寒冷和快速增重時(shí)需氧量增加）時(shí)，使機(jī)體組織氧自由基的產(chǎn)生和脂質(zhì)過(guò)氧化增加，生理水平的活性氧，具有抗炎、抵御外來(lái)病原體的入侵等作用，對(duì)于維持血管正常功能具有積極意義［16］。病理?xiàng)l件下，機(jī)體內(nèi)活性氧的積聚過(guò)多，則會(huì)引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，對(duì)組織和細(xì)胞直接造成氧化損傷和（或）啟動(dòng)氧化還原信號(hào)途徑，促進(jìn)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，不能夠合成、釋放血管內(nèi)皮衍生舒張因子等活性物質(zhì)，抑制前列環(huán)素（PGI2）合成酶，激活血栓素合成酶，使血栓素A2（TXA2）大量生成，破壞PGI2／TXA2平衡，引起血小板聚集并釋放活性因子，導(dǎo)致血栓形成，血流阻力加大和內(nèi)膜增生，血管舒張受阻，形成肺動(dòng)脈高壓［17］。Enkvetchakul等［2］和楊四軍等［18］認(rèn)為不良條件下肉雞發(fā)生腹水綜合癥時(shí)，組織中線粒體內(nèi)源性氧自由基增多，在亞細(xì)胞水平上參與了疾病的病理過(guò)程，是導(dǎo)致AS發(fā)生重要因素。異黃酮類化合物是一種天然抗氧化劑，羥基能夠?qū)涔┙o脂類化合物自由基，降低了自動(dòng)氧化鏈反應(yīng)的傳遞速度。紅車軸草異黃酮中鷹嘴豆芽素A有2個(gè)羥基，芒柄花素有一個(gè)羥基，具有較強(qiáng)的抗氧化性。SOD和GSH－Px是生物體重要的抗氧化酶，能夠降低氧自由基的積累，減輕氧化損傷［19，20］，減少M(fèi)DA的積累。試驗(yàn)中添加紅車軸草異黃酮肉雞血清和肝臟組織中MDA含量低于低溫組，脂質(zhì)過(guò)氧化作用得到減輕。紅車軸草異黃酮抗氧化的另一個(gè)原因，是作用于產(chǎn)生自由基的酶，低溫條件下添加黃酮后，使肉雞血清和肝臟組織中SOD和GSH－Px活性增強(qiáng)。李曉莉等［21］研究證明染料木黃酮可以顯著抑制慢性缺氧小鼠MDA的產(chǎn)生，促進(jìn)一氧化氮的生成，提高SOD活性。向瑞平等［22］研究表明肉雞抗氧化能力增強(qiáng)可降低AS發(fā)病率，低溫加T3誘導(dǎo)的AS，添加抗氧化劑Vc和Ve，肉雞發(fā)病率以及組織中的SOD升高，MDA含量顯著降低。李錦春等［23］限制光照提高了肉雞抗氧化酶活性并減輕體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化作用，減少自由基的產(chǎn)生，減輕以非肌型肺動(dòng)脈肌型化為特征的肺血管重構(gòu)。紅三葉異黃酮能夠降低自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化，減輕對(duì)機(jī)體組織細(xì)胞的損傷，增強(qiáng)自身的防護(hù)作用。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)紅三葉異黃酮一定程度上抑制了低溫誘導(dǎo)的AS的影響，提高抗氧化性能，這可能是降低AS發(fā)病率的部分機(jī)制之一，但紅三葉異黃酮與AS之間關(guān)系的更深層次的機(jī)理尚待進(jìn)一步研究。

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