鳳仙花植株乙醇浸提液和固體粉劑對瘤胃體外發(fā)酵代謝參數的影響

王東升，黃江麗，張志紅，田曉娟，黃黃，印遇龍，丁建南＊

（1.江西省科學院生物資源研究所，江西 南昌330029；2.中國科學院亞熱帶農業(yè)生態(tài)研究所，湖南 長沙410125）

甲烷是主要的溫室氣體之一，其溫室效應是二氧化碳的20～30倍。畜牧業(yè)對全球溫室效應的貢獻率為9%～18%，而反芻動物排放的甲烷約占其中80%［1］。反芻動物通過瘤胃中微生物發(fā)酵利用纖維素、半纖維素等結構性碳水化合物，在此過程中產生大量氫氣和二氧化碳，而瘤胃中產甲烷菌利用氫氣和二氧化碳進行還原反應生成甲烷，甲烷再以暖氣的方式經口排出體外。反芻動物瘤胃內生成的甲烷不僅加劇了溫室效應，同時也降低了飼料利用率，造成2%～15%飼料總能的損失［2］。因此，減少瘤胃內甲烷的生成對提高飼料能量利用率和改善環(huán)境具有重要意義，研究調控反芻動物瘤胃甲烷排放的措施和方法已成為降低溫室效應熱點之一。反芻動物瘤胃形成后通過不同措施進行微生態(tài)調控，降低甲烷的產生，如羔羊28天時前胃功能發(fā)育已基本完成，此時可調控瘤胃發(fā)酵，降低甲烷排放［3］。減少甲烷排放的途徑主要有改變日糧組成，添加脂類物質、抗生素和植物提取物等。研究發(fā)現(xiàn)，日糧不同精粗組合對反芻動物瘤胃內揮發(fā)性脂肪酸、產氣量以及甲烷產生有不同影響［4，5］。添加脂類物質如植物油后，瘤胃pH明顯提高，瘤胃微生物活性發(fā)生變化，甲烷菌活性受到抑制，甲烷的排放減少，進而提高動物的生產性能和飼料利用率［6］。肉牛日糧中添加葵花籽油，甲烷排放減少22%，總能損失減少21%［7］。莫能菌素是離子載體型抗生素，明顯抑制甲烷菌活性［8］，在反芻動物上應用降低體內25%甲烷生成。但是，長期使用莫能菌素會使瘤胃微生物產生適應性，并且畜產品中殘留的抗生素對人體健康存在潛在威脅。因此，開發(fā)綠色、無污染飼料添加劑越來越受到關注，其中植物提取物研究比較多。絞股藍和絲蘭等含皂甙類植物提取物，不僅減少瘤胃中原蟲數量，降低原蟲對細菌的吞噬以及甲烷排放，而且調控瘤胃發(fā)酵模式，提高飼料能量的利用效率，同時這類物質還有效提高動物機體抵抗力，預防疾病發(fā)生，改善動物產品質量［9，10］。

鳳仙花（Impatiens balsamina）是鳳仙花科鳳仙花屬植物，為一年生草本植物，主要分布于熱帶地區(qū)及亞熱帶地區(qū)，在中國主要產于西南地區(qū)［11］。鳳仙花含有豐富的化學成分，主要含有糖類、黃酮類、醌類、甾醇類、香豆素類等多種活性成分，具有抗過敏、抗真菌、抗炎等多種藥理作用［12］。本研究小組在篩選降甲烷藥用植物時發(fā)現(xiàn)，與青蒿（Artemisia annua）、蒲公英（Taraxacum mongolicum）、麻黃（Herba ephedrae）等植物比較，鳳仙花具有明顯的降甲烷效果［13］。試驗采用體外厭氧培養(yǎng)技術，比較鳳仙花植株固體粉劑和乙醇浸提液對瘤胃產甲烷、微生物蛋白（MCP）、氨態(tài)氮（NH3－N）和揮發(fā)性脂肪酸（VFA）等發(fā)酵參數的影響，通過這些特征指標的分析，探討鳳仙花作用機理，為以后的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 添加劑和人工飼料 降甲烷添加劑包括鳳仙花和莫能菌素。鳳仙花為本所植物遺傳育種研究室栽培，開花后期整株采收，全株風干后粉碎過1mm篩成為固體粉劑。固體粉劑分別在50℃、70%乙醇中浸泡48h，料液比為1∶4，浸泡之后用超聲波提取，超聲波頻率為20kHz，提取溫度為50℃。通過抽濾得到粗提液，在60℃左右將粗提液濃縮到總體積的1／5，即為鳳仙花乙醇浸提液。莫能菌素是40%預混劑，購自江西省南昌市獸醫(yī)防疫站。人工飼料選用黃豆粒、玉米粒和稻草，分別將這3種材料粉碎后過1mm篩備用。

1.1.2 瘤胃液采集 瘤胃液取自裝有永久瘤胃瘺管的黃牛，試驗動物每天飼喂2次，飼喂時間點為7：00和17：00，自由飲水。2011年5－6月份取樣試驗。晨飼2h后采集瘤胃瘺管中新鮮瘤胃液，迅速裝入充有氮氣自封袋中，并用39℃保溫瓶帶回實驗室。將采集的瘤胃液用4層脫脂紗布在大燒杯中過濾，過濾時在厭氧袋中操作，減少微生物與空氣的接觸。量取所需體積瘤胃液迅速加入到準備好的人工唾液中（瘤胃液與人工唾液體積比為1∶2），制成混合人工瘤胃培養(yǎng)液，人工瘤胃培養(yǎng)液在實驗開始前新鮮配制。人工唾液由微量元素溶液、緩沖液、常量元素溶液和還原劑溶液等組成，具體配制參照Menke和Steingass［14］的方法。

1.1.3 瘤胃體外培養(yǎng)裝置 本研究使用的體外厭氧瘤胃培養(yǎng)裝置是在王全軍等［15］所用培養(yǎng)裝置基礎上改造而成，裝置由兩部分組成，培養(yǎng)瓶和50mL玻璃注射器（浙江寧波和平注射器廠），兩者之間通過帶控制閥的軟管連接。培養(yǎng)瓶中放入人工瘤胃培養(yǎng)液和飼料，瓶口用反口膠塞密封。在膠塞上插入軟管的尖頭部分，軟管末端連接注射器。用密封帶和膠布密封并固定軟管的尖頭部分，注射器用橡皮筋固定在培養(yǎng)瓶外。注射器每次使用之前用凡士林涂抹注射器，消除注射器內腔和塞之間摩擦。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計 采用二因子設計，因子1為鳳仙花固體粉劑和乙醇提取物，因子2為添加劑的添加量，添加量設3個梯度，鳳仙花乙醇浸提液添加量分別是培養(yǎng)液體積的0.5%，1.0%和2.5%（mL／mL，E1、E2和E3）；固體粉劑添加量分別是培養(yǎng)液體積的0.5%，1.0%和2.5%（g／mL，S1、S2和S3）。試驗設正負對照，負對照為無任何添加劑（CK）；正對照為莫能菌素，添加量為30mg／L（M），莫能菌素添加量參考相關文獻［16］。每一處理設7個平行，每個培養(yǎng)瓶為一平行，試驗連續(xù)重復4批次。

1.2.2 體外培養(yǎng) 分別稱取稻草粉、玉米粉和黃豆粉0.90g，0.45g和0.15g，組成體外厭氧培養(yǎng)所用人工飼料。將人工飼料送入250mL培養(yǎng)瓶內，按照處理加入不同添加劑。在厭氧操作袋中打開培養(yǎng)瓶，分別向每個瓶中加入人工瘤胃培養(yǎng)液200mL，與人工飼料混合均勻。迅速蓋上膠塞，插上軟管的尖頭部分，打開軟管的控制閥，用針頭導入高純氮氣，驅趕瓶中剩余空氣，確保培養(yǎng)瓶內為厭氧環(huán)境。將培養(yǎng)瓶放入（39±0.5）℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵培養(yǎng)。在12，18和24h記錄注射器讀數，測定注射器內甲烷（CH4）和二氧化碳（CO2）含量。各個處理的注射器讀數與校正對照比較后 （只有培養(yǎng)液沒有飼料底物），轉變成產氣量。公式為：產氣量＝Vt－Vi，其中，Vt為各處理發(fā)酵t小時的注射器讀數，Vi為校正對照發(fā)酵t小時的注射器讀數。發(fā)酵至終點后收集各處理發(fā)酵液，測定pH、氨態(tài)氮（NH3－N）、微生物蛋白（MCP）和3種揮發(fā)性脂肪酸（VFA）。

1.2.3 測定方法 CO2和CH4測定：CO2含量用GASBOARD沼氣分析儀（武漢四方光電科技有限公司）測定；CH4用島津氣相色譜儀器測定，測定條件為：HP－INNOWAX（19091N－133）毛細管柱，測定條件為柱溫80℃，氣化室溫度100℃，檢測室溫度120℃，載氣使用高純氮氣。用10μL微量注射器分別抽取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0μL甲烷標準氣，根據甲烷濃度和其峰面積關系，確定甲烷標準曲線，具體條件參照胡偉蓮等［17］方法。

發(fā)酵液參數測定：發(fā)酵液pH值用梅特勒－托利多酸度計直接測定；NH3－N含量測定采用水楊酸鈉－次氯酸鈉比色法，具體過程參照馮宗慈和高民［18］的方法；MCP含量測定參照Makkar等［19］分步離心法進行樣品的預處理，考馬斯亮藍（G250）比色法測定蛋白含量。測定揮發(fā)性脂肪酸含量時，取培養(yǎng)液1mL，加0.2mL濃度為25%的偏磷酸，4℃高速離心（12 000r／min）10min，測定上清液中3種VFA含量。配制6個梯度的乙酸、丙酸和丁酸的混合標樣，用于制作標準曲線。氣相色譜測定的柱溫為180℃，氣化室溫度為200℃，檢測室溫度為220℃，具體條件參照相關文獻［17］。培養(yǎng)液中VFA主要由乙酸、丙酸和丁酸組成，三者之和為總揮發(fā)酸（TVFA）。

1.3 統(tǒng)計分析

數據采用Excel 2003軟件進行記錄整理，試驗結果用平均值±標準誤表示，統(tǒng)計分析采用SAS V8軟件的Duncan氏法進行多重比較，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結果與分析

2.1 鳳仙花對產氣量的影響

比較不同處理體外培養(yǎng)中的產氣量（表1），12h測定結果中，莫能菌素（M）處理的產氣量最低，比對照（CK）顯著低56.9%，所有鳳仙花處理產氣量高于CK，鳳仙花固體粉劑高濃度處理（S3）比CK高86.9%，同時也顯著高于其他鳳仙花處理（P＜0.05）。18h產氣量中，莫能菌素處理產氣量也是最低，固體粉劑3個添加量S1、S2和S3均顯著高于鳳仙花乙醇浸提液3個處理（P＜0.05）。24h培養(yǎng)結束時，莫能菌素處理依然保持最低，S3處理最高，所有鳳仙花處理均顯著高于CK和莫能菌素處理（P＜0.05）。比較各處理3次總產氣量，鳳仙花固體粉劑最高，3個添加量分別比CK高42.4%，57.0%和70.9%，乙醇浸提液3個添加量分別比CK高16.6%，25.2%和32.2%，莫能菌素處理比CK顯著低27.8%（P＜0.05）。因此，鳳仙花與莫能菌素處理對產氣量的影響結果相反。鳳仙花2種制劑添加量和產氣量之間表現(xiàn)出一定正比關系，添加量低，產氣量低，添加量高，產氣量也相應提高。

表1 鳳仙花乙醇浸提液和固體粉劑對體外發(fā)酵產氣的影響Table 1 Effects of ethanol extract and plant solid powder of I.balsaminaon gas production in vitro rumen fermentation

2.2 鳳仙花對CH4和CO2的影響

比較12hCH4差異（表1），含量最高是CK，莫能菌素處理明顯較低，比CK顯著低89.7% （P＜0.05）。鳳仙花固體粉劑3個處理都為0；乙醇浸提液3個處理分別比CK顯著低85.3%，83.8%和95.6% （P＜0.05）。分析18和24h測定結果，CK中CH4含量在所有處理中保持最高，莫能菌素顯著低于CK（P＜0.05），分別比CK低84.9%和74.3%。鳳仙花固體粉劑S3處理抑制CH4生成，2個較低添加濃度處理中僅有微量CH4；乙醇浸提液3個添加量18h測定結果比CK分別低72.3%，85.6%和97.9%，24h測定結果比CK低32.8%，77.1%和98.0%（P＜0.05）。

CO2變化與CH4相反，與產氣量變化趨勢相似。不同時間取樣測定結果中，莫能菌素處理均為最低，平均比CK低22.6%。在鳳仙花2種制劑中，固體粉劑對CO2提高明顯，各添加量平均比CK高109.5%，54.5%和89.6% （P＜0.05），乙醇浸提液各添加量分別比CK 高31.8%，44.8%和70.5%。

2.3 鳳仙花對pH的影響

發(fā)酵培養(yǎng)結束時，測定瘤胃液中的pH，比較所有處理，莫能菌素最高（表2），比CK高0.2%（P＞0.05）；鳳仙花處理均比CK低，并且隨著添加量的提高，降低更明顯。鳳仙花乙醇浸提液3個添加量分別比CK低1.9%，2.8%和4.7%，固體粉劑處理分別比CK低3.5%，5.4%和8.4%（P＜0.05）。

表2 鳳仙花乙醇浸提液和固體粉劑體外發(fā)酵代謝參數的影響Table 2 Effects of ethanol extract and plant solid powder of I.balsaminaon metabolic parameters in vitro rumen fermentation

2.4 鳳仙花對MCP和NH3－N的影響

NH3－N和MCP是瘤胃微生物發(fā)酵2個重要指標，反映了瘤胃代謝狀態(tài)。結果顯示（表2），CK中NH3－N含量最高，其他處理均顯著低于CK（P＜0.05），莫能菌素處理比CK低16.3%，乙醇浸提液3個處理比CK低12.8%，29.7%和48.2%，固體粉劑3個處理比CK低41.1%，52.2%和55.4%。添加量相同時，鳳仙花固體粉劑降低效果比乙醇浸提液明顯。體外發(fā)酵液中MCP結果與NH3－N不同，莫能菌素處理的MCP最低，比CK低1.8%（P＞0.05），鳳仙花處理的 MCP均高于CK，固體粉劑3個添加量分別比CK高84.9%，139.7%和199.7%（P＜0.05），乙醇浸提液分別比CK高60.0%，77.4%和94.8%。

2.5 鳳仙花對VFA的影響

比較各處理乙酸含量（表2），莫能菌素處理最低，比CK低3.6%（P＞0.05）；鳳仙花處理平均比CK高14.9%，比莫能菌素處理高19.3%。鳳仙花處理之間沒有明顯區(qū)別，但是2種處理方式表現(xiàn)為先升高后降低趨勢，與其他發(fā)酵參數變化規(guī)律不同。比較丙酸差異，CK含量最低，莫能菌素處理比CK高11.5%（P＞0.05）；鳳仙花固體粉劑平均比CK高33.7%（P＜0.05），乙醇浸提液平均比CK高21.4%。結果中看出，丁酸在3種揮發(fā)性脂肪酸中所占比例最小，莫能菌素處理的丁酸含量最低，比CK低2.3%（P＞0.05）；固體粉劑平均比CK高12.2%，乙醇浸提液平均比CK高10.7%。比較3種揮發(fā)性脂肪酸總量（TVFA），莫能菌素處理最低，比CK低1.4%（P＞0.05）；固體粉劑比CK平均高20.2%，乙醇浸提液比CK平均高12.9%。對于乙酸／丙酸，CK最高，莫能菌素處理比CK低13.5%（P＜0.05），鳳仙花固體粉劑比CK平均低11.45%，乙醇浸提液比CK低8.1%。本試驗中，鳳仙花處理不同程度提高瘤胃中乙酸、丙酸和丁酸含量，TVFA也隨著3種酸含量的提高而提高，降低乙酸／丙酸。

3 討論

莫能菌素（Monensin）是反芻動物應用較廣的飼料添加劑，具有減少瘤胃甲烷生成、提高飼料轉化效率功效。莫能菌素在一定用量內對產氣總量影響不明顯，但是明顯提高二氧化碳含量［16，20］。本試驗中，莫能菌素用量在30mg／L時，CH4降低，產氣量和CO2也下降，分析認為與用量較多有關。鳳仙花不同添加量明顯降低CH4含量，劑量越高效果越明顯。研究表明，飼料有機物質的消化率與體外培養(yǎng)時的產氣量具有高度相關性，產氣量越高，表明飼料在瘤胃內的發(fā)酵活動越劇烈［21］。鳳仙花明顯提高產氣量和CO2含量，表明添加的鳳仙花刺激了瘤胃微生物代謝活動，提高某些微生物活性；另外，當CH4生成受到抑制時，造成CO2和H2等累積［22］。

MCP代謝是瘤胃微生物區(qū)系營養(yǎng)代謝的一個重要的組成部分，是反芻動物最主要的氮源供應者［23］。本試驗中，體外培養(yǎng)24h后，鳳仙花處理MCP測定結果均比CK高。試驗結果表明，鳳仙花處理刺激了瘤胃微生物代謝活動，加快瘤胃微生物蛋白合成，促進NH3－N向MCP轉化。此結果與茶皂素等植物提取物具有減少瘤胃NH3－N濃度、促進MCP合成結論一致［24］。添加莫能菌素降低MCP含量，與莫能菌素抑制革蘭氏陽性細菌活性、引起瘤胃細菌數量下降等有關［8］。瘤胃液pH值是反映瘤胃內發(fā)酵狀況的一項綜合指標，pH值過高或過低對瘤胃微生物生長、發(fā)育及發(fā)酵均有不利的影響［25］。本試驗中，莫能菌素pH比CK高0.2%，差異不顯著，添加鳳仙花引起pH值明顯降低，分析原因可能是鳳仙花處理影響瘤胃微生物菌群，提高了揮發(fā)性脂肪酸（VFA）含量。pH變化與飼料配比有關［26］，本研究中飼料配比對鳳仙花引起的pH變化緩沖效果差，在以后研究中需要調整飼料組成和配比。另外，由于試驗采用不連續(xù)體外發(fā)酵，不能及時排除代謝產物而造成大量有機酸類物質累積［27］。有文獻報道VFA是反芻動物和瘤胃微生物維持和生長的主要能量來源，瘤胃內各VFA百分率反映瘤胃微生物的發(fā)酵類型及養(yǎng)分吸收情況［28］。鳳仙花處理提高瘤胃中乙酸、丙酸和丁酸含量，TVFA也隨著提高，而乙酸／丙酸下降，可能是鳳仙花不僅促進飼料能量的利用，而且還改變了瘤胃代謝模式，結果與茶皂甙和延胡索酸二鈉效果相同［29，30］。

比較鳳仙花乙醇浸提液以及固體粉劑體外瘤胃發(fā)酵效果，從CH4、CO2和MCP等數據看，濃度相同時，固體粉劑的效果最好，乙醇浸提液效果較差。當直接添加固體粉劑時，其中含有的少量對多糖、蛋白質等營養(yǎng)物質也被微生物利用，促進瘤胃微生物發(fā)酵，所以效果更明顯。

4 結論

鳳仙花乙醇浸提液和固體粉劑均能有效降低CH4產生，促進NH3－N向MCP轉化，添加量高時（2.5%）效果更明顯，固體粉劑的效果最好，并且用量較大時，沒有副作用。綜上所述，鳳仙花有望成為反芻動物新型瘤胃發(fā)酵調控劑。

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