枇杷DXR基因的克隆及其在果實(shí)成熟過程中的表達(dá)分析

張玲　林順權(quán)等

摘 要：【目的】為了解枇杷（Eriobotrya japonica Lindl.）1-脫氧木酮糖-5-磷酸（DXP）還原異構(gòu)酶基因（DXR）的序列特點(diǎn)及其在果實(shí)成熟過程的表達(dá)特性，【方法】以不同類型枇杷品種‘早鐘6號(hào) （紅肉） 和‘白玉（白肉）不同成熟階段的果肉和果皮為試材，采用RT-PCR 結(jié)合RACE 法和qRT-PCR方法對(duì)DXR基因進(jìn)行了克隆，并對(duì)其在枇杷果實(shí)成熟過程中的表達(dá)進(jìn)行了分析，【結(jié)果】枇杷DXR基因的cDNA序列全長1 743 bp，編碼473個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量（Mw）為51 299.8 Da，等電點(diǎn)（pI）為6.52（GenBank 登錄號(hào)：JX089590）。qRT-PCR分析表明，在枇杷果實(shí)成熟過程中，DXR在不同類型枇杷的不同時(shí)期表達(dá)不盡相同：在果皮中，‘早鐘6號(hào)品種的DXR基因在果實(shí)成熟的各個(gè)階段的表現(xiàn)為表達(dá)量較為穩(wěn)定，而在‘白玉品種中，DXR基因的表達(dá)存在較為明顯的先增加后降低的過程，其表達(dá)量在褪綠期達(dá)到最高。而在果肉中，無論是‘早鐘6號(hào)還是‘白玉品種，DXR基因的表達(dá)從果實(shí)成熟過程中的未轉(zhuǎn)色期到黃熟期表現(xiàn)為持續(xù)下降；到成熟期時(shí)，‘早鐘6號(hào)品種的DXR基因存在明顯的上調(diào)現(xiàn)象，而在‘白玉品種中則無此明顯變化，【結(jié)論】DXR基因?qū)τ阼凌祟惡}卜素的合成沒有限制作用，至少作用不明顯。

關(guān)鍵詞： 枇杷； 果實(shí)； DXR； 基因克?。?實(shí)時(shí)熒光定量PCR

中圖分類號(hào)：S667.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980？穴2013？雪04-0563-04

在植物體內(nèi)，異戊基焦磷酸（IPP）是類胡蘿卜素合成途徑中第一個(gè)較為直接的前體物質(zhì)，而類胡蘿卜素的生物合成所需的IPP絕大多數(shù)都來自質(zhì)體2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸（MEP）途徑[1]。1-脫氧木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶（DXR）基因能催化1-脫氧木酮糖-5-磷酸（DXP）先異構(gòu)后還原轉(zhuǎn)化成 MEP；DXP除了用于合成萜類物質(zhì)之外，還可以用于非萜類物質(zhì)維生素B1和維生素B6的合成，但DXP一旦經(jīng)DXR轉(zhuǎn)化形成的MEP只能再轉(zhuǎn)化成萜類物質(zhì)，因此，DXR活性的高低決定了DXP用于萜類物質(zhì)合成的比例，從而對(duì)類胡蘿卜素的合成起到十分重要的作用。DXR基因首先在擬南芥中報(bào)道[2]，隨后Carretero-Paulet等[3]研究指出：DXR基因由單基因編碼，可在多種組織中廣泛表達(dá)。近年來，在長春花[4]、玉米[5]、金魚草[6]、銀杏[7]、橡膠[8]等多種植物中先后克隆出了該基因。

枇杷果實(shí)的主要色素是類胡蘿卜素，其含量與組成賦予果實(shí)不同的顏色。我們通過對(duì)枇杷的DXR基因的克隆、序列分析，并結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)對(duì)不同類型枇杷果實(shí)成熟過程中果肉和果皮DXR表達(dá)量進(jìn)行檢測，初步明確DXR的表達(dá)規(guī)律，從而為研究枇杷類胡蘿卜素的積累與DXR基因的表達(dá)之間的關(guān)系提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 枇杷總RNA的提取及DXR基因cDNA全長的獲得 枇杷總RNA的提取參照張玲等[9]的方法。以‘早鐘6號(hào)總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其中DXR基因保守片段的擴(kuò)增引物參考金蓉[10]設(shè)計(jì)的引物。在獲得DXR基因的保守片段之后，分別采用3' RACE方法擴(kuò)增3' 末端序列，5' RACE采用同聚物加尾的方法進(jìn)行。用天根公司的DNA回收純化試劑盒對(duì)目的片段進(jìn)行回收純化，并與pMD19-T載體（TaKaRa）連接，轉(zhuǎn)化E. coli DH5α，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。所有測序均由上海美吉生物有限公司完成。將所得保守片段、3' 和5' 片段序列進(jìn)行拼接，重新設(shè)計(jì)特異引物，以‘早鐘6號(hào)總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板擴(kuò)增DXR基因cDNA全長。表1示DXR基因克隆所用引物。

1.2.2 基因生物信息學(xué)分析 利用生物信息學(xué)軟件BLAST比對(duì)分析，找出起始密碼子、完整的開放閱讀框、終止密碼子、5' 非編碼區(qū)、3' 非編碼區(qū)和poly（A）尾巴；并通過DNAMAN軟件，將核苷酸序列翻譯成氨基酸序列，預(yù)測分析蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)，同時(shí)進(jìn)行多重序列比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 枇杷DXR基因的克隆和分析

將枇杷DXR基因全長及其推導(dǎo)蛋白質(zhì)與GenBank 中的序列進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)在氨基酸水平上，與玫瑰（AEZ53171.1）、毛果楊（XP_002318048.1）、 橡膠樹（ABD92702.1）、蓖麻（XP_002511399.1）、葡萄（XP_002282761.1）、番茄（NP_001234553.1）、煙草（ABH08964.1）、金魚草（AAW28998.1）、擬南芥（XP_002866510.1）等植物的氨基酸序列同源性都大于83%。其中與玫瑰（AEZ53171.1）DXR 同源性最高，為92%。

2.2 DXR基因在枇杷果實(shí)不同階段的轉(zhuǎn)錄水平分析

3 討 論

在轉(zhuǎn)DXR 基因的擬南芥植株中，下調(diào)該基因表達(dá)引起了花斑、色素沉積減少和葉綠體發(fā)育缺陷；而上調(diào)基因表達(dá)則引起葉綠素、類胡蘿卜素增加，還增加了非轉(zhuǎn)基因植株所沒有的紫杉二烯[11]。但不是所有植物 DXR 基因都與植物萜類物質(zhì)合成有密切關(guān)系。在番茄果實(shí)成熟期間有的類胡蘿卜素大量積累過程中，相關(guān)的DXR基因的 mRNA水平并沒有顯著變化，這說明番茄體內(nèi) DXR 基因?qū)︻惡}卜素合成沒有限制作用[12]。

本研究發(fā)現(xiàn)：在果皮中，‘早鐘6號(hào)的DXR基因在果實(shí)成熟的各個(gè)階段的表達(dá)量無明顯的增加或降低現(xiàn)象，具體表現(xiàn)為表達(dá)量較為穩(wěn)定，而在‘白玉中，DXR基因的表達(dá)存在較為明顯的先增加后降低的過程，特別是轉(zhuǎn)色期和褪綠期，其表達(dá)量均明顯高于‘早鐘6號(hào)品種，但到了果實(shí)成熟期，‘早鐘6號(hào)和‘白玉果皮類胡蘿卜素含量卻無明顯差異。而在果肉中，特別是在果實(shí)成熟期，與‘白玉相比，‘早鐘6號(hào) DXR基因有一個(gè)明顯上調(diào)的現(xiàn)象，其相對(duì)表達(dá)量約為‘白玉的2倍左右，但不足以解釋在果實(shí)成熟期‘早鐘6號(hào)和‘白玉果肉類胡蘿卜素含量相差達(dá)10倍之多。由此我們可以推論：DXR基因的對(duì)于枇杷類胡蘿卜素的合成沒有限制作用，至少作用不明顯。Fu等[13]研究了不同類型枇杷‘洛陽青和‘白沙果實(shí)發(fā)育過程中的質(zhì)體變化及質(zhì)體脂結(jié)合蛋白基因（PAP）的表達(dá)情況，指出‘白沙枇杷果肉中不能形成正常的有色體是其類胡蘿卜素含量低的原因，PAP可能在枇杷果實(shí)有色體形成和轉(zhuǎn)換中起重要作用?！珑?號(hào)和‘白玉不同品種以及果皮和果肉類胡蘿卜素的積累差異是否也與此有關(guān)，需要進(jìn)一步驗(yàn)證。（本文圖版見插4）

參考文獻(xiàn) References：

[1] RODR？魱GUEZ-CONCEPCI？譫N M， BORONAT A. Elucidation of the methylerythritol phosphate pathway for isoprenoid biosynthesis in bacteria and plastids. A metabolic milestone achieved through genomics[J]. Plant Physiol， 2002， 130（3）： 1079-1089.

[2] ZHANG Shang-long， CHEN Kun-song. Moloecular physiology of fruit quality development and regulation[M]. Beijing： China Agriculture Press，2007： 119-121.

張上隆，陳昆松. 果實(shí)品質(zhì)形成與調(diào)控的分子生理[M]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社，2007： 119-121.

[3] CARRETER-PAULET L， AHUMADA I， CUNILLERA N， RODRIGUEZ-CONCEPCION M ， FERRER A， BORONAT A， CAMPOS N. Expression and molecular analysis of the Arabidopsis DXR gene encoding 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase， the first committed enzyme of the 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate pathway[J]. Plant Physiol， 2002， 129（4）： 1581-1591.

[4] VEAR B， COURTOIS M， OUDIN A， CHENIEUX J C， RIDEAU M， CLASTRE M. Cloning and expression of cDNAs encoding two enzymes of the MEP pathway in Catharanthus roseus[J]. Biochim Biophys Acta， 2000， 1517（1）： 159-163.

[5] HANS J，HAUSE B，STRACK D，WALTER MICHAEL H. Cloning， characterization， and immunolocalization of a mycorrhiza- inducible 1-deoxy-d-xylulose-5-phosphate reductoisomerase in arbuscule-containing cells of maize[J]. Plant Physiol， 2004， 134（2）： 614-624.

[6] DUDAREVA N， ANDERSSON S， ORLOVA I， GATTO N， REICHELT M， RHODES D， BOLAND W， GERSHENZON J. The nonmevalonate pathway supports both monoterpene and sesquiterpene formation in snapdragon flowers[J]. Proc Natl Acad Sci U S A， 2005， 102（3）： 933-938.

[7] GONG Yi-fu， LIAO Zhi-hua， CHEN Min， ZUO Kai-jing， GUO Liang， TAN Qiu-min， HUANG Zhuo-shi， KAI Guo-yin， SUN Xiao-fen， TAN Feng， TANG Ke-xuan. Molecular cloning and characterization of a 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase gene from Ginkgo biloba[J]. DNA Seq， 2005， 16（2）： 111-120.

[8] SEETANG-NUN Y， SHARKEY T D， SUVACHITTANONT W. Molecular cloning and characterization of two cDNAs encoding 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase from Hevea brasiliensis[J]. J Plant Physiol， 2008， 165（9）： 991-1002.

[9] ZHANG Ling， LIN Shun-quan， YANG Xiang-hui. Extraction of total RNA from loquat fruit and cloning of phytoene synthase gene fragment[J]. Journal of Fruit Science， 2012，29（4）： 577-582.

張玲，林順權(quán)，楊向暉. 枇杷果實(shí)總RNA的提取及八氫番茄紅素合成酶基因（PSY）片段的克隆[J]. 果樹學(xué)報(bào)， 2012，29（4）： 577-582.

[10] JIN Rong. Differential expression of carotenoid biosynthesis genes in red navel orange and ordinary navel orange fruits[D]. Zhejiang： Zhejiang University， 2007.

金蓉. 紅肉臍橙和普通臍橙果實(shí)類胡蘿卜素合成基因的差異表達(dá)[D]. 浙江： 浙江師范大學(xué)， 2007.

[11] CARRETERO-PAULET L， CAIR？譫 A， BOTELLA-PAV？魱A P， BESUMBES O， CAMPOS N， BORONAT A， RODR？魱GUEZ-CONCEPCI？譫 M. Enhanced flux through the methylerythritol 4-phosphate pathway in Arabidopsis plants overexpressing ， deoxyxylulose 5-phosphate reductoisomerase[J]. Plant Mol Biol， 2006， 62 （4-5）： 683 -695.

[12] RODR？魱GUEZ-CONCEPCI？譫N M， AHUMADA I， DIEZ-JUEZ E， SAURET-G？譈ETO S， MARíA LOIS L， GALLEGO F， CARRETERO-PAULET L， CAMPOS N， BORONAT A.1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase and plastid isoprenoid biosynthesis during tomato fruit ripening[J]. Plant J，2001，27（3）： 213-221.

[13] FU Xiu-min， KONG Wen-bin， PENG Gang， ZHOU Jing-yi， AZAM M， XU Chang-jie， GEIERSON D， CHEN Kun-song. Plastid structure and carotenogenic gene expression in red-and white-fleshed loquat （Eriobotrya japonica） fruits[J]. Journal of Experimental Botany， 2012， 63（1）： 341-354.