桃果實糖、酸QTL定位和候選基因分析研究進展

張佳卉　王力榮等

摘 要：果實糖、酸含量及其比例是評價桃果實品質(zhì)的重要指標。主要綜述桃果實糖、酸代謝關(guān)鍵酶和糖、酸QTLs的定位和候選基因研究進展。桃果實糖、酸代謝基本途徑關(guān)鍵酶有蔗糖合成酶、蔗糖酸性轉(zhuǎn)移酶、山梨醇氧化酶、山梨醇脫氫酶、NADP+-蘋果酸酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、檸檬酸合酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶等；通過遺傳連鎖圖譜構(gòu)建和連鎖分析已定位到多個糖、酸組分QTLs，絕大多數(shù)位于第1、3、4、5、6、8連鎖群；通過關(guān)鍵酶編碼基因與QTLs共座位方法，分離到一系列候選基因。結(jié)合桃基因組測序數(shù)據(jù)，總結(jié)調(diào)控桃果實糖、酸性狀的可能候選基因。針對目前桃糖、酸基因定位研究中存在的問題，展望實現(xiàn)桃果實糖、酸基因定位和單個基因克隆的新方法。

關(guān)鍵詞： 桃； 糖； 酸； QTLs；

中圖分類號：S662.1 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980？穴2013？雪04-0688-09

據(jù)世界糧農(nóng)組織統(tǒng)計，2011年我國桃栽培面積有76.73萬hm2，產(chǎn)量1153萬t，占世界面積和產(chǎn)量的48.86%和53.55%，位居世界第1位（FAOSTAT： http：//faostat.fao.org/）。

品質(zhì)是商品果的核心[1]，但果實品質(zhì)性狀多為數(shù)量性狀，遺傳調(diào)控機制復雜，難以把握其遺傳規(guī)律。因此在育種上果實品質(zhì)無法在較短時間內(nèi)取得快速有效的改良，限制育種進程[2]。研究表明，在近20 a里，歐美等國家桃消費量并無增長趨勢，主要原因是桃品質(zhì)育種進程緩慢，品質(zhì)未能更好地滿足消費者需求[3]。因此，品質(zhì)改良是目前桃育種的主要方向之一。桃果實內(nèi)在品質(zhì)主要有糖、酸、糖/酸、可溶性固形物、維生素C含量以及香氣等[1]，其中糖、酸含量及糖酸比是決定果實口感的主要因素[4-7]。由此，從分子水平上闡明桃果實糖、酸遺傳機理，了解種質(zhì)資源的糖、酸遺傳特性，對培育高品質(zhì)桃品種具有重大意義。

1 桃果實糖、酸組分

桃果實可溶性糖主要有蔗糖（約占可溶性糖的54%～75%）、葡萄糖（9%～21%）、果糖（3%～25%）、山梨醇（4%～11%）等[6]。山梨醇是主要的光合產(chǎn)物[8]，并且果實風味在很大程度上取決于山梨醇轉(zhuǎn)化為其它糖的類型[9]。但在果實成熟時山梨糖醇含量卻很低。桃果實中主要有機酸有蘋果酸（約占總酸的50%～60%）、檸檬酸（20%～25%）和奎寧酸（20%～25%）[10]，此外還有含量極少的莽草酸 [11-12]。

1.1 桃果實糖、酸組分與品質(zhì)

研究證明，糖酸比大于20、含酸量在0.4%以下、pH大于4的桃品種以甜風味為主；糖酸比在10以下、含酸量大于0.4%以上、pH值小于3的桃品種風味酸[2]。從各組成因素而言，甜度與檸檬酸、莽草酸含量及糖酸比有關(guān)，口感與總糖、蔗糖、山梨醇和蘋果酸含量以及蘋果酸和檸檬酸比例有關(guān)[13]。果實香氣可能與奎寧酸和莽草酸有關(guān)?？鼘幩岷兔Р菟崾欠枷阄镔|(zhì)合成途徑之一—莽草酸途徑的中間產(chǎn)物[12]，這2種有機酸可能直接轉(zhuǎn)化為芳香化合物或參與芳香化合物的合成從而間接影響果實香氣。桃果實各個化學組分之間有一定的關(guān)系，即糖、酸含量之間存在相關(guān)性[14]。這些組分的相關(guān)性，可能是因為糖或酸在代謝上相互聯(lián)系，即糖、酸各組分在果實成熟過程中和成熟后的代謝途徑相互交聯(lián)。

1.2. 果實糖、酸組分代謝關(guān)鍵酶

DeJong等[15]認為桃果實發(fā)育過程可分為3個階段：第I階段，果實細胞快速分裂階段；第II階段，果實生長緩慢，內(nèi)果皮開始硬化，為硬核期；第III階段，果實細胞快速膨大的生長階段。在果實發(fā)育的第I階段，蔗糖合酶（Sucrose synthase， SS）和蔗糖酸性轉(zhuǎn)移酶（Acid invertase， AI）以及山梨醇脫氫酶（Sorbitol dehydrogenase， SDH）和山梨醇氧化酶（Sorbitol oxidase， SOX）都具有活性[16-18]，說明初期山梨醇可能被轉(zhuǎn)化為蔗糖和葡萄糖。Lo Bianco（2002）觀察到SS、AI、SOX、SDH的活性與生長速率只在果實發(fā)育的第I、III階段存在顯著相關(guān)性[19]，而Yamada等[20]通過檢測編碼這些酶的基因表達情況也發(fā)現(xiàn)SDH僅在第I、III階段表達。說明在果實發(fā)育過程中，這些酶催化蔗糖和山梨醇分解，一部分為果實發(fā)育提供能量，另一部分分解為其他貯存物質(zhì)如葡萄糖、有機酸等。因此，這些酶參與調(diào)控果實大小和品質(zhì)[19，21]。

在酸組分代謝方面，依賴于NAD+的蘋果酸酶（NAD+-ME）在果實從第I階段向第II階段轉(zhuǎn)變時，活性顯著下降，而在果實膨大期到成熟期該酶的活性又恢復到果實發(fā)育初期時的活性；依賴于NADP+的蘋果酸酶，在果實發(fā)育第I階段、第III階段活性增強；磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）在第III階段活性有短暫的略微下降；檸檬酸合酶（CS）在第III階段活性顯著增加；磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）（催化草酰乙酸轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇式丙酮酸）活性在果實發(fā)育初期顯著增加，在果實膨大后期其活性達發(fā)育初期的50倍，果實成熟采摘后PEPCK活性更高[22]。這些結(jié)果表明第I和第III階段是有機酸代謝旺盛期，發(fā)生一系列有機酸的合成和降解的過程，影響果實的最終糖酸含量。

綜上，蔗糖合成酶，蔗糖酸性轉(zhuǎn)移酶，山梨醇氧化酶，山梨醇脫氫酶，依賴于NADP+的蘋果酸酶，檸檬酸合酶等是決定果實品質(zhì)的關(guān)鍵酶，推測與糖、酸轉(zhuǎn)移有關(guān)的載體和質(zhì)子泵在果實品質(zhì)決定中扮演著重要角色。

1.3 桃果實糖、酸含量影響因素

桃果實糖、酸組分及其代謝過程比較復雜，受遺傳因素、生理、環(huán)境條件和栽培措施等多方面的影響。

王力榮[23]、吳本宏等[24]研究認為油桃基因型可溶性固形物和總糖高于普通桃。王力榮[23]研究表明油桃和蟠桃基因具有增大果實固形物的作用。王力榮[23]、吳本宏等[24]、Wen等[25]研究表明油桃基因型的可滴定酸含量高于普通桃。因此基因型對桃和油桃的糖、酸含量具有重要影響[26]。此外，成熟期、光照、溫度、水分供應和其他栽培措施等也可能影響桃果實的糖、酸含量[27-32]。

影響桃果實糖、酸含量的因素較多，但遺傳因素扮演重要角色。因此利用分子生物學手段發(fā)掘調(diào)控桃果實糖、酸含量的關(guān)鍵酶，闡明桃果實糖信號、激素信號與外界環(huán)境信號之間的聯(lián)系和調(diào)控，有機酸的跨膜運輸和載體蛋白的調(diào)控機制，為提高果實品質(zhì)提供理論依據(jù)。

2 桃果實糖、酸QTLs研究

目前在桃上已構(gòu)建多個遺傳連鎖圖譜，通過這些圖譜，定位到多個糖、酸QTLs，并分離到部分QTLs的候選基因。

2.1 桃遺傳連鎖圖譜構(gòu)建

2.2 桃果實糖、酸QTLs

目前已經(jīng)定位的糖、酸相關(guān)的QTLs，絕大多數(shù)位于LG1、3、4、5、6、8，有機酸相關(guān)的QTLs主要位于LG5頂端的D基因區(qū)域，但目前尚不明確該區(qū)域內(nèi)影響有機酸和總酸含量是一因多效引起，還是因為多個QTLs成簇的結(jié)果。SSC QTLs在LG1、3、4、5、6有分布，且所報道的QTLs中，主要在LG2、4、6上，蔗糖QTLs在LG3、4、5、6、7都有報道，但LG5上最多，且某些QTL在不同定位群體都能夠被檢測到；葡萄糖QTLs在LG 1、4、5、6、7、8都被檢測到，但主要分布在LG4。另外，果糖QTLs主要分布在LG4，位置與很多SSC的 QTLs重合，這可能意味著LG4存在調(diào)控果糖和SSC含量的QTL或者QTL簇；山梨醇、檸檬酸、草莽酸、蘋果酸和奎寧酸所檢測到的QTLs數(shù)目都比以上其他性狀少，并發(fā)現(xiàn)某些報道的位點所解釋的表型變異都較高，如山梨醇在LG6上的QTL解釋75.1%的表型變異，檸檬酸在LG5的QTLs解釋81.7%的表型變異，蘋果酸在LG5在多個群體中都被檢測到解釋很大比例的表型變異，奎寧酸在LG6有2個解釋表型變異率較高的位點（35.1%和43.1%），草莽酸主要在LG3。這些解釋較大表型變異的QTL 區(qū)域，特別是在多個群體中都被檢測到，可能存在著調(diào)控這一性狀的關(guān)鍵基因[2，44，49-50]。

2.3 桃果實糖、酸QTLs的精細定位與候選基因

Ebenezer等[41]通過分子標記和候選基因圖譜與其他圖譜對比分析，將候選基因類比錨定到其他圖譜上，以此推斷并驗證這些圖譜上已定位到的QTL的候選基因。通過與T×E圖譜對比，在LG5頂端D基因區(qū)域，相應的基因是過氧化氫酶（Catalase，Cat）基因位點Cat1。通過與Dirlewanger等[40]利用‘ Ferjalou JalousiaבFantasia構(gòu)建的圖譜對比，發(fā)現(xiàn)在LG6上定位到的與SSC和鮮果重有關(guān)的QTLs對應的候選基因有丙氨酸-乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因（Alanine-glyoxylate aminotransferase， AGAT）、C端磷酸化酶樣結(jié)構(gòu)域基因（C-terminal domain phosphatase-like，CDPTL）、超氧化物歧化酶基因（Superoxide dismutase， SOD）、堿性螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋轉(zhuǎn)錄因子（BZIP transcription factor， bZIP）和谷氨酸葡萄糖-6-磷酸合成轉(zhuǎn)移酶基因（Glutamine-fructose-6-phosphate transaminase， C-PPN）；LG4定位到的SSC和果糖含量QTLs[2]相應的候選基因是倍半萜烯環(huán)化酶基因（Sesquiterpene cyclase， SeCy）、S-腺苷甲硫氨酸-2-甲基萘醌甲基轉(zhuǎn)移酶基因（S-adenosylmethionine： 2-demethylmenaquinone methyltransferase， SAMM）和甘油磷酰二酯酶基因（glycerophosphoryl diester phosphodiesterase， GDPPDE）。這些候選基因在基因克隆和功能研究中有一定的參考價值。

2.4 桃全基因組測序

3 討 論

桃果實品質(zhì)提升主要是糖、酸含量及其比例的改良。目前通過連鎖分析已定位到多個糖、酸性狀相關(guān)QTLs，并在一些區(qū)域篩到相應候選基因；部分QTLs對某一糖、酸組分貢獻率較大，推測這個區(qū)域可能存在調(diào)控果實糖、酸含量的重要基因。這類QTLs的存在說明糖、酸組分可能受若干主效基因和多個微效基因的調(diào)控，因此可通過篩選主效QTLs進行品質(zhì)改良。在第5連鎖群頂部定位到低酸位點（D位點），在多個研究中都被檢測到[44，53，55]，說明其可能普遍存在于桃群體中；該位點存在蘋果酸、蔗糖、檸檬酸、pH和可滴定酸相關(guān)的QTLs；研究發(fā)現(xiàn)D基因位點可降低有機酸含量和增加蔗糖含量[44]，對提高糖酸比十分有利，在育種上有重要價值，應給予重視。

目前的研究在一定程度上推動了對桃果實品質(zhì)遺傳機制的認識，但也存在一定的問題。一是連鎖分析選用兩個親本雜交的群體作為研究對象，體現(xiàn)的是兩個等位基因之間的差異，基因的廣度窄，導致所構(gòu)圖譜多態(tài)性低，較大比例的標記在后代群體中表現(xiàn)為單一同態(tài)[3，56]。不能充分了解種質(zhì)資源群體的糖酸遺傳背景，不利于調(diào)控品質(zhì)的優(yōu)異等位基因的發(fā)掘，限制了種質(zhì)資源的運用價值。桃起源于我國，種質(zhì)資源豐富，其中野生資源可能存在調(diào)控糖酸和抗性的優(yōu)異等位基因。如吳本宏測定野生種和栽培種的雜交后代果實中主要糖、酸含量，結(jié)果顯示雜交后代糖、酸含量具有明顯超親現(xiàn)象，說明野生桃基因組中可能存在提高受體栽培種糖、酸含量的QTLs[11]。所以通過高世代回交將野生種質(zhì)中的優(yōu)異基因?qū)氲絻?yōu)良栽培種中，不僅可獲得抗病性強的栽培種，還可獲得高糖、酸含量的優(yōu)異栽培種。二是未實現(xiàn)調(diào)控糖、酸性狀基因的克隆?；蚩寺『凸δ芊治鍪菍蜻M一步運用的基礎(chǔ)。目前已鑒定到某些標記與調(diào)控糖、酸的關(guān)鍵QTLs緊密連鎖，但這些標記可能僅在某兩個親本間存在多態(tài)性，而在其它品種上不存在多態(tài)性，因此不能作為選擇標記對基因型進行有效選擇。目前，在水稻上，通過基因克隆，研究基因序列在種質(zhì)資源中的變異，根據(jù)這些變異設(shè)計一套相應的功能標記作為選擇標記，可在育種中對某一基因型進行檢測[57]。該方法在桃分子育種中有可借鑒之處。綜上，連鎖分析結(jié)果在桃育種上的應用十分有限。

4 展 望

桃基因組測序數(shù)據(jù)和功能基因注釋信息的公布極大地推動桃基因定位和克隆的進展。目前通過桃基因組測序和基因注釋，共預測有27852個編碼蛋白和非編碼RNA的基因[58]。因此，對于某一個糖、酸QTL，可參考QTL所在標記區(qū)間內(nèi)的基因組注釋信息而獲得候選基因，再驗證候選基因，篩選目的基因，實現(xiàn)單基因的精細定位和克隆。這在一定程度上克服林木生長周期長而不易構(gòu)建高世代群體進行基因圖位克隆的缺點。

關(guān)于桃果實糖、酸QTLs研究中存在的基因廣度窄的問題，目前提出的基于連鎖不平衡（Linkage disequilibrium， LD）的關(guān)聯(lián)分析（Association analysis），根據(jù)基因歷史重組事件鑒定可能存在的重要農(nóng)藝性狀QTLs位點的方法或有一定的可行性[59]。進行關(guān)聯(lián)分析的最大優(yōu)點是無需構(gòu)建專門的作圖群體，以來自不同生態(tài)群的地方品種組成的自然群體和野生資源等為材料，不受傳統(tǒng)遺傳群體的“兩親本范圍”限制；可檢測到群體內(nèi)大多數(shù)的等位基因，增加基因研究廣度；若結(jié)合種質(zhì)資源基因組測序數(shù)據(jù)，構(gòu)建高密度單核型圖譜，基因定位可精確到單基因水平[60-61]。如Huang等[62]通過測序517個栽培稻品種，發(fā)現(xiàn)360萬個SNP，利用性狀與SNP關(guān)聯(lián)研究秈稻亞種14個農(nóng)藝性狀，發(fā)現(xiàn)其中6個位點與目前已克隆的基因極其靠近。我們首次將關(guān)聯(lián)分析引入桃基因定位研究，通過104份中國桃地方品種，53對多態(tài)性李屬SSR引物，關(guān)聯(lián)定位到桃果實近核處顏色、果肉顏色、黏離核、需冷量、盛花期、果實硬度、成熟期和果實發(fā)育期等性狀的QTLs[63]，研究結(jié)果與前人連鎖分析結(jié)果一致，說明關(guān)聯(lián)分析方法在桃基因定位中具有可行性。此外，目前提出的轉(zhuǎn)錄組測序和表觀遺傳研究，可對現(xiàn)有基因組數(shù)據(jù)作一定補充。轉(zhuǎn)錄組分析可獲得多個涉及糖、酸代謝的基因，這些基因可為單QTL的定位和克隆提供參考。在實現(xiàn)基因克隆之后，可通過研究基因-基因互作或者表觀遺傳信息，探究基因表達調(diào)控機制，從分子水平了解糖、酸含量調(diào)控機制，并運用于糖、酸的分子育種，實現(xiàn)高品質(zhì)桃新品種的選育。

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