蘋果實(shí)生砧木資源重要性狀的遺傳多樣性分析

邢麗敏　槐心體　張新忠　王憶　韓振海

摘 要： 【目的】為了解蘋果實(shí)生砧木資源重要砧木性狀的種間、居群間和株系間差異及株系內(nèi)性狀分離，【方法】搜集了7個(gè)種21份蘋果資源的種子，建立實(shí)生群體，播種當(dāng)年調(diào)查實(shí)生苗株高、干粗、葉形指數(shù)和分枝數(shù)等形態(tài)性狀，當(dāng)年秋芽接富士和金冠品種，第2年調(diào)查實(shí)生苗越冬抽條率、耐鹽性、嫁接芽萌芽率、抽梢率和成苗率。通過(guò)接種鑒定評(píng)價(jià)腐爛病和輪紋病的抗病性?！窘Y(jié)果】形態(tài)性狀種間差異顯著，平邑甜茶形態(tài)一致性好。1 a生實(shí)生苗耐越冬抽條能力種間差異大。栽培品種實(shí)生苗耐抽條能力差，且易感蘋果輪紋病。八棱海棠和平頂海棠耐鹽堿性較強(qiáng)，山定子耐鹽堿性差，且居群間差異極顯著。腐爛病和輪紋病的抗病性均存在種間、居群間或株系間差異及嚴(yán)重的株系內(nèi)性狀分離。平邑甜茶和小金海棠的嫁接芽抽梢率和秋季成苗率均低?！窘Y(jié)論】多數(shù)性狀不僅種間、居群間或株系間差異顯著，株系內(nèi)性狀也嚴(yán)重分離。選育、應(yīng)用蘋果無(wú)性系砧木是迫切需求。

關(guān)鍵詞： 蘋果； 實(shí)生砧木； 種質(zhì)資源； 遺傳多樣性

中圖分類號(hào)：S661.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980？穴2013？雪04-0516-10

中國(guó)擁有豐富的蘋果屬（Malus Mill.）種質(zhì)資源，是世界上蘋果屬植物最大的基因中心，有17種蘋果屬植物起源于中國(guó)并仍有分布[1]。在這些種質(zhì)資源中蘊(yùn)藏著豐富的具有利用及潛在利用價(jià)值的資源，其中湖北海棠[M. hupehensis （Pamp.）Rehd.]、山定子[M. baccata （L.） Borkh.]、西府海棠（M. micromalus Makino）、楸子[M. prunifolia （Willd.）Borkh.]、新疆野蘋果[M. sieversii （Led.） Roem.]等這些種常用作蘋果實(shí)生砧木。研究實(shí)生砧木的種間差異和種內(nèi)遺傳多樣性對(duì)合理利用砧木種質(zhì)資源、實(shí)現(xiàn)蘋果實(shí)生砧木區(qū)域化有重要意義。

因?yàn)樘O果屬植物大多數(shù)種間不存在生殖隔離，不同的種間容易雜交，再加上種的多倍化和無(wú)融合生殖現(xiàn)象，使得蘋果屬植物不僅種間差異顯著，而且種內(nèi)遺傳多樣性十分豐富。用8對(duì)SSR引物對(duì)蘋果屬的23個(gè)種、種間雜種和品種進(jìn)行遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)種質(zhì)資源間存在豐富的遺傳變異，等位基因的雜合度平均為0.623，多態(tài)性均值為0.828[2]。構(gòu)建新疆野蘋果分離群體時(shí)，新疆野蘋果與栽培品種‘紅富士雜交得到的110株后代，株系間沒(méi)有重復(fù)現(xiàn)象[3]。不僅如此，蘋果屬植物種內(nèi)也存在著豐富的多樣性。用8對(duì)SRR引物對(duì)65份湖北海棠材料進(jìn)行檢測(cè)，其中6對(duì)得到的多態(tài)信息含量（PIC）超過(guò)0.80，而各個(gè)居群內(nèi)的基因型卻高度一致，表明居群內(nèi)遺傳多樣性水平較低，因此湖北海棠種內(nèi)變異主要來(lái)自居群間[4]。相反，用RAPD標(biāo)記輔助分析新疆野蘋果種內(nèi)多樣性，發(fā)現(xiàn)居群內(nèi)遺傳多樣性占種內(nèi)遺傳多樣性的83.1%[5]。對(duì)新疆野蘋果進(jìn)行SSR分析的結(jié)果表明居群間和居群內(nèi)遺傳多樣性水平分別為15%和85%，均說(shuō)明新疆野蘋果種內(nèi)遺傳多樣性主要來(lái)源于居群內(nèi)[6-8]。

我國(guó)山定子、海棠果等蘋果屬資源分布區(qū)廣泛，分布區(qū)之間氣候和土壤條件差異大，通過(guò)長(zhǎng)期的地理隔離、自然選擇和人工選擇，使得蘋果種質(zhì)資源產(chǎn)生了豐富的居群間遺傳多樣性。湖北海棠雖然無(wú)融合生殖能力強(qiáng)居群內(nèi)表現(xiàn)一致，但是居群間變異幅度較大[4，9]。此外，用RAPD標(biāo)記對(duì)東北、華北地區(qū)山定子8個(gè)天然居群分析，發(fā)現(xiàn)居群間基因分化系數(shù)（Gst）值為0.223 7，表明山定子居群間也存在著較高的遺傳分化[10]。

長(zhǎng)期的無(wú)性繁殖和自交不親和導(dǎo)致蘋果屬植物實(shí)生居群內(nèi)的株系間甚至同株系的植株間性狀廣泛分離。用分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)山定子（I值變化為0.270 1～0.452 6） [10]、湖北海棠（I值變化為0.032 7～0.255 3）[9]、變?nèi)~海棠（多態(tài)性帶百分率值為36.43～62.96）[11]等居群內(nèi)，進(jìn)行遺傳多樣性分析的結(jié)果，均說(shuō)明了蘋果屬種質(zhì)資源在居群內(nèi)也存在著豐富的變異。

我們通過(guò)田間調(diào)查、接種鑒定等方法系統(tǒng)評(píng)價(jià)了蘋果屬7個(gè)種、21份蘋果實(shí)生砧木資源在形態(tài)性狀、抗病性、抗逆性等方面的種間差異及種內(nèi)遺傳多樣性，對(duì)進(jìn)一步認(rèn)識(shí)實(shí)生砧木導(dǎo)致的變異以及實(shí)生砧木區(qū)域化利用提供理論指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 材料

于2011年3月溫室營(yíng)養(yǎng)缽播種育苗，5月上旬定植于中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)八口果樹(shù)實(shí)驗(yàn)基地苗圃。每份材料株數(shù)均在90株以上。畦寬1.2 m，雙行定植，株距20 cm，常規(guī)水肥管理和病蟲害防治。于2011年9月初芽接，每份材料分別嫁接富士、金冠各半。

試驗(yàn)中用于抗病分析的菌株，包括5種輪紋病菌株分別為MX1、LS1、ZZ26、LW023、LW048，其中LW023和LS1對(duì)蘋果枝干的致病性最強(qiáng)，LW048和ZZ26致病性中等，MX1致病性最弱[12-13]。蘋果腐爛病菌株分別為xc56和03-8均為強(qiáng)致病性菌株[14]。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)指標(biāo) 形態(tài)指標(biāo)的調(diào)查于2011年秋季新梢停止生長(zhǎng)時(shí)進(jìn)行，分別調(diào)查1 a生實(shí)生苗的株高、干徑、分枝數(shù)量和葉片的長(zhǎng)寬。每個(gè)實(shí)生群體中設(shè)3次重復(fù)，每次重復(fù)隨機(jī)選取30株。用游標(biāo)卡尺測(cè)定植株距地面10 cm處的干徑，用卷尺測(cè)量株高，在植株中間部位隨機(jī)選取5枚成熟葉片分別用游標(biāo)卡尺測(cè)量它們的長(zhǎng)度和寬度，以長(zhǎng)/寬的比值表示葉形指數(shù)。

1.2.2 蘋果腐爛病抗病性 休眠期對(duì)21份砧木資源進(jìn)行蘋果腐爛病抗病性枝條離體接種鑒定。菌株用劉欣穎等[15]報(bào)道的方法培養(yǎng)。采用改良后的菌餅接菌的方法對(duì)枝條進(jìn)行接菌，每份資源以10根30 cm的枝段為1次重復(fù)，共設(shè)3次重復(fù)。枝條洗凈并用70%的酒精對(duì)表面進(jìn)行消毒，晾干后用Ф5 mm的打孔器在每段枝條上均勻打3個(gè)直至木質(zhì)部的孔；用Ф5 mm的打孔器在菌落邊緣打菌，將菌絲面貼向枝條上的小孔，再附上蘸有無(wú)菌水的脫脂棉保濕，用封口膜固定菌餅和脫脂棉；將接菌后的枝條放入培養(yǎng)箱中26 ℃恒溫培養(yǎng)；7 d后調(diào)查接種孔發(fā)病情況，測(cè)量病斑長(zhǎng)度。按劉欣穎等[15]報(bào)道的方法計(jì)算發(fā)病嚴(yán)重度。

1.2.3 蘋果輪紋病抗病性 2012年春季從21份種質(zhì)各取30株生長(zhǎng)一致的實(shí)生苗，移栽到塑料口徑30 cm營(yíng)養(yǎng)缽中，置溫室內(nèi)。每株實(shí)生苗保留3根生長(zhǎng)健壯的新梢用于抗輪紋病性活體接種鑒定。于2012年7月份接菌。蘋果輪紋病病菌培養(yǎng)，枝干接菌和評(píng)價(jià)方法參照文獻(xiàn)[12-13]的方法。

1.2.6 嫁接親和性調(diào)查 嫁接親和性調(diào)查內(nèi)容包括：嫁接芽的萌發(fā)率（萌芽材料占總材料的比率）、萌發(fā)后抽梢率（萌芽并抽梢材料占萌芽材料的比率）以及嫁接苗成苗率（嫁接最終成苗材料占嫁接成活材料的比率）。21份種質(zhì)均嫁接了金冠和富士2種接穗，所以每份種質(zhì)對(duì)嫁接親和性的調(diào)查都分兩部分進(jìn)行，將每份種質(zhì)嫁接同種接穗的所用材料，按株數(shù)平均分為3組來(lái)統(tǒng)計(jì)。5月初調(diào)查萌芽率及抽梢率，9月中旬完成成苗率的調(diào)查。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用Excel 2007軟件進(jìn)行分析，用算術(shù)平均數(shù)來(lái)表征各數(shù)值性狀的的平均水平，用標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)等作為考查各性狀群體內(nèi)離散度的指標(biāo)。顯著性用最小顯著差數(shù)法（LSD）進(jìn)行多重比較，用相關(guān)系數(shù)來(lái)說(shuō)明變量間的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)指標(biāo)測(cè)量結(jié)果及分析

除平邑甜茶之外，蘋果實(shí)生砧木的許多性狀在居群間、株系間、株系內(nèi)均存在廣泛分離，株系內(nèi)的變異系數(shù)甚至與種間變異系數(shù)相當(dāng)，蘋果屬實(shí)生砧木資源存在豐富的表型多樣性。與砧木資源相比蘋果品種實(shí)生苗的形態(tài)性狀變異較小。

2.2 蘋果腐爛病抗性

2.3 蘋果輪紋病枝干抗病性

各種質(zhì)資源枝干接種蘋果輪紋病后發(fā)病的病情指數(shù)，種間變異系數(shù)為55.04%，山定子居群間為53.88%，其變異幅度接近種間水平；各株系間除平邑甜茶的株系間（CV=8.65%）變異較小外，變異系數(shù)均大于20%；株系內(nèi)變異系數(shù)平均值為92.6%。綜合表明，種間、居群間、居群內(nèi)的株系間以及株系內(nèi)均存在明顯分離。

由圖2可以看出，輪紋病的5種菌株與蘋果屬的各種質(zhì)之間同樣存在互作現(xiàn)象。其中楸子對(duì)ZZ26菌株有特異的抗性，而平邑甜茶材料7#E1N9對(duì)ZZ26菌株特異敏感，新疆野蘋果對(duì)LS1和LW023敏感。

2.4 耐抽條

2.5 耐鹽堿

試驗(yàn)田土壤pH為8.12，全鹽量為0.35 g·kg-1，屬于輕微鹽堿化。種質(zhì)資源黃化指數(shù)在重復(fù)間（F=0.18，F(xiàn)0.05=3.24 ）無(wú)顯著差異，但種間（F=7.16，F(xiàn)0.01=3.41）差異極顯著（圖4）。山定子黃化指數(shù)高于其他砧木種，其中最嚴(yán)重的為遼寧居群的X-1-23和X-7-35，黃化指數(shù)分別為0.50和0.37。而八棱海棠（黃化指數(shù)為0.05）和平頂海棠（黃化指數(shù)為0.06）黃化指數(shù)低。山定子的不同居群間（F=10.01，F(xiàn)0.01=5.49）存在極顯著差異；遼寧的山定子、平邑甜茶株系間（F=6.42，F(xiàn)0.05=5.14；F=10.86，F(xiàn)0.05=5.14）都存在顯著差異，而山西的山定子株系間（F=0.55，F(xiàn)0.05=3.11）無(wú)顯著差異。株系內(nèi)的變異幅度不一致，平邑甜茶的株系12#N-1和7#E1N9、山定子株系S-1和S-2-1及楸子5個(gè)株系內(nèi)變異系數(shù)小于20%。

黃化指數(shù)種間的變異系數(shù)為56.24%，山定子居群間為44.11%，變異水平都比較高；株系間變異系數(shù)均值為28.52%；株系內(nèi)變異系數(shù)從5.41%到103.25%，八棱海棠（CV=103.25%）、平頂海棠（CV=70.06%）株系內(nèi)變異系數(shù)高于居群間和種間變異系數(shù)。表明本試驗(yàn)?zāi)望}堿性狀的變異主要體現(xiàn)在種間和居群間差異，株系內(nèi)耐鹽堿性因物種而異。

2.6 嫁接親和性

秋季芽接富士和金冠接穗后，翌年春季調(diào)查接穗萌芽率和抽梢率，秋季調(diào)查成苗率。結(jié)果表明，3個(gè)指標(biāo)在重復(fù)間（F=1.29、1.33、0.30，F(xiàn)0.05=3.09）和接穗品種間（F=0.30、0.00、1.23，F(xiàn)0.05=3.94）差異均不顯著。在砧木種間、居群間以及來(lái)源于遼寧的山定子株系間均存在顯著差異（表5）。栽培品種實(shí)生苗和新疆野蘋果萌芽率低。小金海棠和平邑甜茶抽梢率和成苗率均低于其他砧木，X-1-23和X-4-25的成苗率低，尤其嫁接金冠（圖5）。

萌芽率（CV=39.00%）、抽梢率（CV=12.47%）在種間變異幅度較大；而嫁接苗成苗率在居群間（CV=23.26%）、遼寧山定子株系間（CV=37.08%）變異幅度大。各砧木資源的株系內(nèi)萌芽率和抽梢率的變異系數(shù)均小于20%，有些砧木資源成苗率株系內(nèi)變異幅度大，如X-1-23（CV=43.33%）、X-4-25（CV=33.44%） 及楸子（CV=27.41%）。

對(duì)萌芽率與抽條指數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，萌芽率與實(shí)生苗的抽條指數(shù)之間存在極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=-0.96（r0.05=0.43，r0.01=0.55）、決定系數(shù)r2=0.927 9。說(shuō)明嫁接芽未萌芽主要與春季抽條有關(guān)。

3 討 論

形態(tài)性狀的差異是植物分類的重要依據(jù)，蘋果實(shí)生砧木資源豐富，種間形態(tài)差異大。播種當(dāng)年實(shí)生苗株高、干徑及分枝數(shù)與苗木繁育直接相關(guān)[16]。本試驗(yàn)結(jié)果所有供試砧木播種當(dāng)年均能達(dá)到離皮芽接的適宜高度和粗度，但新疆野蘋果等實(shí)生砧木分枝數(shù)多，對(duì)嫁接工效有影響。調(diào)查的4個(gè)形態(tài)性狀中，平邑甜茶表現(xiàn)出極高的形態(tài)一致性，與其無(wú)融合能力較高直接相關(guān)。山定子、懷來(lái)海棠也是我國(guó)重要實(shí)生砧木，懷來(lái)海棠包括八棱海棠和平頂海棠[17]。本研究山定子、八棱海棠、平頂海棠等砧木資源株系內(nèi)形態(tài)性狀分離嚴(yán)重。

有些重要砧木性狀，如1 a生實(shí)生苗耐抽條能力，砧木資源間的變異主要來(lái)源于種間差異。對(duì)于同一植物學(xué)種，耐抽條性狀在居群間、株系間差異以及株系內(nèi)的分離程度不大。蘋果良種繁育實(shí)踐中選擇實(shí)生砧木時(shí)選用適宜的植物學(xué)種即可[18]。生產(chǎn)上反對(duì)以蘋果栽培品種實(shí)生苗作砧木繁育苗木[19]。本試驗(yàn)亦證明蘋果栽培品種實(shí)生苗耐抽條能力差，且易感蘋果輪紋病。

對(duì)于有些砧木性狀，砧木資源的種間差異和居群間差異均較大。前人通過(guò)對(duì)蘋果屬各種內(nèi)不同地理來(lái)源的居群的表型性狀進(jìn)行分析，認(rèn)為花葉海棠、變?nèi)~海棠、新疆野蘋果等居群內(nèi)變異要高于居群間，而山定子居群的材料和湖北海棠的天然居群在居群間的變異顯著高于居群內(nèi)變異[20-24]。本文數(shù)據(jù)顯示，相比其他砧木資源，八棱海棠和平頂海棠的黃化指數(shù)低，耐鹽堿性較強(qiáng)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[1]。相反，山定子黃化指數(shù)高，且居群間黃化指數(shù)差異極顯著。另外，山定子居群間嫁接成苗率變異系數(shù)大。因此，生產(chǎn)上選擇山定子作實(shí)生砧木時(shí)關(guān)注種子產(chǎn)地十分重要。

對(duì)枝干病害的抗病性也是砧木性狀的重要指標(biāo)。蘋果種質(zhì)資源對(duì)蘋果腐爛病、蘋果枝干輪紋病的抗病性存在顯著的種間差異和豐富的種內(nèi)遺傳多樣性[13，15，25-26]。本研究結(jié)果表明供試的實(shí)生砧木資源對(duì)蘋果腐爛病和蘋果輪紋病的抗病性不僅存在顯著的種間差異，均存在顯著的居群間或株系間差異以及嚴(yán)重的株系內(nèi)性狀分離。即使在形態(tài)性狀一致性較好的平邑甜茶資源中，對(duì)蘋果腐爛病的抗病性也存在顯著的株系間差異和株系內(nèi)性狀分離。蘋果良種繁育實(shí)踐中選擇實(shí)生砧木，既要選擇抗病性較強(qiáng)的種，也應(yīng)關(guān)注種子產(chǎn)地，還要對(duì)采種母樹(shù)進(jìn)行選擇。即使如此，株系內(nèi)的性狀分離仍無(wú)法消除。本研究還發(fā)現(xiàn)，不同砧木資源對(duì)腐爛病或輪紋病的不同菌株的敏感性存在差異，與之前的研究結(jié)果完全相符[12-13，15]。

一般認(rèn)為，無(wú)融合生殖率高的物種或類型的實(shí)生后代性狀一致性好。平邑甜茶和小金海棠的無(wú)融合生殖坐果率分別為95.4%和86.7%[27-28]。本研究證明平邑甜茶形態(tài)一致性好，但小金海棠形態(tài)性狀變異系數(shù)與其他砧木相似。因?yàn)樾〗鸷Ｌ碾m然無(wú)融合坐果率高，其實(shí)生群體中無(wú)融合生殖后代占51.27%，而無(wú)融合生殖后代染色體倍性也出現(xiàn)分離[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，平邑甜茶的3個(gè)株系和小金海棠的實(shí)生苗秋季芽接，翌春接芽抽梢率和秋季成苗率均顯著低于其他砧木資源，可能與接穗/砧木間的染色體倍性差異有關(guān)。平邑甜茶是湖北海棠中的一個(gè)三倍體類型，本研究中的小金海棠是四倍體[30]。

綜上，蘋果實(shí)生砧木資源重要性狀不僅存在極顯著的種間差異，相同物種的不同生態(tài)居群間或株系間亦存在極顯著差異，而且多數(shù)性狀株系內(nèi)性狀分離十分嚴(yán)重。選育、應(yīng)用蘋果無(wú)性系砧木是我國(guó)蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展的迫切需求。

致謝：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植病系國(guó)立耘教授惠贈(zèng)輪紋病菌株，西北農(nóng)林科技大學(xué)黃麗麗教授提供腐爛病菌株03-8，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所周宗山研究員提供腐爛病菌株xc56。西北農(nóng)林科技大學(xué)趙政陽(yáng)教授、黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院牡丹江分院果樹(shù)研究所劉延杰研究員、遼寧省果樹(shù)科學(xué)研究所伊凱研究員、山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所楊廷楨研究員、山東省青島市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院沙廣利研究員、張家口市林業(yè)科學(xué)研究所楊海廷高級(jí)工程師、西南大學(xué)園藝學(xué)院周志欽教授協(xié)助采集實(shí)生砧木種子，謹(jǐn)致謝忱。

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