DNA分子標(biāo)記在動(dòng)物保護(hù)生物學(xué)中的應(yīng)用

任 艷 魏 磊

（宿州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 安徽·宿州 234101）

保護(hù)生物學(xué)要解決的首要問(wèn)題是人類面臨的一系列生物多樣性危機(jī)的原因和需要加以保護(hù)的問(wèn)題。 遺傳多樣性是種上水平各類多樣性來(lái)源的基礎(chǔ)，也是保護(hù)生物學(xué)研究的核心內(nèi)容。 對(duì)于稀有種、特有種和小種群來(lái)說(shuō)往往出現(xiàn)遺傳上的衰退， 即遺傳多樣性的降低。 造成遺傳衰退的原因有選擇作用、群體有效大小降低、遺傳漂變以及自交等等，較低的遺傳多樣性會(huì)導(dǎo)致較低的環(huán)境適應(yīng)能力和易受到環(huán)境突變的影響。 因此，從分子水平上檢測(cè)其近親繁殖的程度、基因流程度、種群間的雜交和基因滲透情況，對(duì)保護(hù)物種的遺傳多樣性具有重要意義。 目前，物種正以驚人的速率消失， 這種非演替性的滅絕正在不斷減少物種的多樣性。 2004 年3 月出版的《科學(xué)》雜志上發(fā)表的英國(guó)野生動(dòng)物調(diào)查報(bào)告稱， 一直被認(rèn)為是由很強(qiáng)恢復(fù)能力的昆蟲(chóng)也和眾多大型動(dòng)物和植物一樣，正在面臨滅絕的命運(yùn)，比如蝴蝶，其物種滅絕速率甚至比鳥(niǎo)類還大， 拯救物種是保護(hù)生物學(xué)的緊迫任務(wù)。 保護(hù)生物學(xué)研究的重點(diǎn)在小種群?jiǎn)栴}，主要是對(duì)已經(jīng)變小的種群進(jìn)行妥善保護(hù)。 研究的焦點(diǎn)集中于種群動(dòng)態(tài)或遺傳變異相關(guān)的問(wèn)題， 關(guān)注導(dǎo)致生物多樣性危機(jī)的原因， 尋找減輕或消除威脅物種繼續(xù)生存的脅迫因子。DNA 分子標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)，為保護(hù)生物學(xué)的研究提供了可靠的研究方法， 是研究種群遺傳多樣性、近交衰退問(wèn)題、分析種群的遺傳結(jié)構(gòu)和適應(yīng)潛力、分類和系統(tǒng)進(jìn)化等的有力工具。 目前，常用的分子標(biāo)記有限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLPs）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 （RAPDs）、 特異性擴(kuò)增長(zhǎng)度多態(tài)性（SAP）、小衛(wèi)星DNA、微衛(wèi)星DNA（SSR）等。

一、DNA 分子標(biāo)記在動(dòng)物保護(hù)生物學(xué)中的應(yīng)用

（一）種群遺傳多樣性檢測(cè)

微衛(wèi)星DNA 分子標(biāo)記技術(shù)是物種遺傳多樣性分析中非常有效的分子標(biāo)記。 微衛(wèi)星，又稱簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple sequence repeat，SSR）。其重復(fù)單位堿基數(shù)目一般為1-6 個(gè)，如（C A ）n，（CAG）n 等（Cao et al 2004）。 微衛(wèi)星重復(fù)序列在群體間和不同的個(gè)體間通常表現(xiàn)出很高的序列變異性， 并且這種變異呈共顯遺傳， 因而微衛(wèi)星重復(fù)序列廣泛應(yīng)用于物種遺傳多樣 性 分 析 （Hadonou et al.，2004；Romero et al.，2003）、連鎖圖譜制作（Staten et al.，2004）疾病連鎖分析（Sakurai et al.，2004）和家系標(biāo)識(shí)（Selvamani et al.，2001）等研究。 由于微衛(wèi)星DNA 標(biāo)記突變率高、多態(tài)性強(qiáng)，因而非常適于分子生態(tài)學(xué)研究，而且，作為一種離散型數(shù)據(jù)信息，微衛(wèi)星具有較多的等位基因，為分子水平上的種群遺傳研究提供了許多便利， 如個(gè)體鑒定、亞種鑒別、種群結(jié)構(gòu)估測(cè)以及種群演化的歷史 分 析 等 （Cottelli et al.，1994；Taylor et al.，1994；Chan and Arcese，2002；Wimmer and Kappeler，2002）。如吳孝兵等（1999）通過(guò)對(duì)飼養(yǎng)種群的家系和有效種群的大小分析發(fā)現(xiàn)揚(yáng)子鱷飼養(yǎng)種群子代鱷已顯示出近交衰退跡象， 導(dǎo)致遺傳多樣性降低并提出了以下管理措施：1）要盡快了解揚(yáng)子鱷種群的遺傳結(jié)構(gòu)，包括全國(guó)各地小種群的遺傳多態(tài)性情況， 尤其要了解兩個(gè)飼養(yǎng)的野生種群的遺傳現(xiàn)狀。 2）掌握揚(yáng)子鱷偶帶中的近交系數(shù)，確定鱷在自然狀態(tài)下的交配系統(tǒng)，是一雄多雌，一雌多雄，或是單配性。 3）指定合理的遺傳管理，以避免近親交配，提高種群的繁殖質(zhì)量。4）對(duì)野生個(gè)體要制定嚴(yán)格的保護(hù)措施，嚴(yán)禁撲殺。 5）盡快掌握所有繁殖種群的性別結(jié)構(gòu)， 確定繁殖種群的性比例。 針對(duì)揚(yáng)子鱷目前的遺傳現(xiàn)狀， 黃磊等（2004，2005）采用微衛(wèi)星DNA（SSR）多態(tài)分析及使用SSR 和mtVNTR 分子標(biāo)記對(duì)揚(yáng)子鱷遺傳多樣性進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，在微衛(wèi)星水平上揚(yáng)子鱷種群表現(xiàn)出很低的遺傳多樣性。 基于此建議：把揚(yáng)子鱷作為一個(gè)整體加以保護(hù)，在建立新的繁殖群體時(shí)，應(yīng)考慮保存物種遺傳多樣性所必需的有效種群的大小， 在遺傳管理上應(yīng)注重低頻等位基因的發(fā)現(xiàn)和保持。 在繁殖群體中人工選擇遺傳差異較大的雌雄個(gè)體配對(duì)繁殖，可最大限度地避免近交。Menotti-Raymond（1993）利用mtDNA 和高度可變地小衛(wèi)星VDTR 對(duì)獵豹地兩個(gè)亞種的遺傳多樣性進(jìn)行研究，結(jié)果表明：兩個(gè)亞種呈中等水平的遺傳變異，支持獵豹大約在10 萬(wàn)年前產(chǎn)生瓶頸效應(yīng)的假說(shuō)。 潘登等（2005）對(duì)川金絲猴群體的微衛(wèi)星多態(tài)性進(jìn)行了研究年，檢測(cè)了來(lái)自于3個(gè)川金絲猴主要棲息地的32 個(gè)樣本的14 個(gè)微衛(wèi)星座，在這些微衛(wèi)星座上檢測(cè)到了多態(tài)；而基于線粒體數(shù)據(jù)比較結(jié)果表明：川金絲猴的遺傳多性水平較低，仍需要采取有效的遺傳保護(hù)措施。 雷初朝等（2005）利用蛋白質(zhì)、RAPD 和微衛(wèi)星技術(shù)， 對(duì)我國(guó)瀕危保護(hù)動(dòng)物——人工飼養(yǎng)朱鹮進(jìn)行遺傳多樣性研究。 結(jié)果表明40 只朱鹮在4 對(duì)微衛(wèi)星位點(diǎn)的平均雜和度為0.3760，平均多態(tài)信息含量為0.3382、平均等位基因數(shù)為2.075。 表明朱鹮人工飼養(yǎng)群體的遺傳多態(tài)性比發(fā)現(xiàn)之初得到一定的恢復(fù)，但仍然比較貧乏。 另外，由于DNA 上的堿基排列順序揭示物種的遺傳信息，在檢測(cè)物種遺傳多樣性時(shí)，DNA 序列分析是最好的分子標(biāo)記。因此，DNA 測(cè)序是檢測(cè)遺傳多樣性最徹底的方法。 另外，AFLP 標(biāo)記在遺傳多樣性檢測(cè)、群體遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳分化分析、 物種親緣關(guān)系分析基因流測(cè)定等方面得到了較廣泛的應(yīng)用， 是一種較新的分子標(biāo)記技術(shù)。

（二）確定物種分類地位

形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)、化石證據(jù)等是傳統(tǒng)分類學(xué)常運(yùn)用方法， 但這些方法的準(zhǔn)確性和可靠性易受環(huán)境因素及個(gè)體發(fā)育情況的影響。 而DNA 分子標(biāo)記能從DNA 分子水平上揭示其內(nèi)在的差異，因而DNA 分子標(biāo)記在分類學(xué)上已被廣泛應(yīng)用。 如線粒體基因組結(jié)構(gòu)中的控制區(qū)（control region）。 線粒體DNA D-Loop區(qū)由于不編碼基因，其DNA 序列的進(jìn)化速度在線粒體基因組中最快，堿基替換率比mtDNA 分子的其它區(qū)域高5-10 倍（趙興波等，1997）。 它是群體遺傳學(xué)研究中最有效和最靈敏的DNA 區(qū)域 （Zhang et al.，1996）。 目前主要集中在遺傳多樣性、系統(tǒng)進(jìn)化、物種識(shí)別以及亞種或種群來(lái)源鑒別等研究領(lǐng)域。 宿兵等（1996）基于D-loop 區(qū)195bp 的序列并結(jié)合形態(tài)學(xué)方面的資料，對(duì)我國(guó)珍稀靈長(zhǎng)類黑冠長(zhǎng)臂猿11 個(gè)個(gè)體進(jìn)行分析， 提出新的分類觀點(diǎn)并將新分類中的3 個(gè)種和3 個(gè)亞種作為不同的進(jìn)化單位（ESUs）進(jìn)行保護(hù)和遺傳管理， 以保護(hù)各類群在進(jìn)化歷史中積累的遺傳變異及其進(jìn)化潛力。 劉海等（2003）測(cè)定了37 只中國(guó)大陸梅花鹿不同種群mtDNA 控制區(qū)5 端351bp的序列，共發(fā)現(xiàn)23 個(gè)變異位點(diǎn)，定義了5 種單元型。分子變異分析表明， 中國(guó)大陸梅花鹿出現(xiàn)了種群分化，支持把分布于東北，華南和四川的梅花鹿種群歸入各自獨(dú)立的管理單元。 中國(guó)大陸、日本南部和日本北部的梅花鹿種群之間無(wú)共享單元型， 且每個(gè)種群的單元型分別組成單系群。

（三）探討種群的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系

DNA 分子標(biāo)記還可以用于種內(nèi)、 種間乃至近緣屬間研究。 特別是動(dòng)物線粒DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）多態(tài)性分析是保護(hù)生物學(xué)和進(jìn)化生物學(xué)研究地一個(gè)強(qiáng)有力地工具 （Wilson et al.，1985；Moritz et al，1987）。 脊椎動(dòng)物線粒體基因組是共價(jià)閉合的雙鏈DNA，長(zhǎng)度在16.5kb，在新陳代謝、細(xì)胞程序性死亡、疾病、衰老等過(guò)程沖具有重要作用。 線粒體組結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，呈嚴(yán)格得母系遺傳，核突變率高等特點(diǎn)，廣泛用于分析動(dòng)物和動(dòng)物類群間的系統(tǒng)關(guān)系，使其成為一種有效的研究物種進(jìn)化的遺傳標(biāo)記（Mindell et al.，1999；Kumazawa et al.，1999；Adalgisa et al.，2004；吳孝兵等，2003；張海軍等， 2004；張亞平，1992；Zhang et al.，2001；周繼亮等， 2001）。 線粒體進(jìn)化速度快， 其基因的堿基替代率使單拷貝基因的5-10 倍 （Piko et al.，1976；Begenhagen et al.，1980；Michaels et al.，1982； Robin et al.，1988）。 所以線粒體DNA 一直是系統(tǒng)進(jìn)化上一種很好的分子標(biāo)記。 尤其對(duì)珍稀動(dòng)物的親緣關(guān)系、系統(tǒng)進(jìn)化的研究，更顯示出了強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)。 吳孝兵等（2003）對(duì)揚(yáng)子鱷線粒體DNA 基因組進(jìn)行全序列測(cè)定，其全長(zhǎng)16746bp，在對(duì)全序列分析的基礎(chǔ)上， 對(duì)12SrRNA、16rRNA 基因序列、 蛋白質(zhì)編碼基因序列及其合并數(shù)據(jù)用MP 法和ML 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，結(jié)果表明：揚(yáng)子鱷與密河鱷的親緣關(guān)系較近，支持傳統(tǒng)觀分類觀點(diǎn)，并指出鈍吻鱷屬的發(fā)生時(shí)間為74.9MaBP， 揚(yáng)子鱷與密河鱷分歧的時(shí)間為50.9MaBP。 如劉忠權(quán)等（2004）測(cè)定了澤蛙線粒體基因組全序列并與其他的6 種兩棲類進(jìn)行詳細(xì)的比較，同時(shí)選擇11 種高等脊椎動(dòng)物的線粒體全基因序列，以硬骨魚(yú)作外群，用22 個(gè)tRNA 基因合并數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生重建分析， 結(jié)果支持現(xiàn)生兩棲類動(dòng)物為單系群，并且有尾目和蚓蠑目尾為姐妹關(guān)系。Janczewski 等（1995）比較了17 種貓科動(dòng)物和5 種食肉目非貓科動(dòng)物的12SrRNA（358bp）和Cytb（289bp）基因的DNA 序列綜合分析顯示：1）較晚進(jìn)化的豹屬是單源的，由獅、豹、虎、雪豹、云豹和美洲豹組成。2）獵豹和美洲獅有新近共同的祖先。 3）亞洲金貓和非洲金貓不是姊妹群。 這些貓科動(dòng)物間較近的分歧大約發(fā)生在100-1000 萬(wàn)年間。

（四）親子鑒定

野外種群極度瀕危物種，就地保護(hù)物種、飼養(yǎng)種群以及動(dòng)物園內(nèi)的動(dòng)物繁殖所面臨的最大問(wèn)題是種群過(guò)小所帶來(lái)的遺傳問(wèn)題。 為了評(píng)估自然交配和人工授精的相對(duì)成功率、 確定生殖能力強(qiáng)盛的雄性個(gè)體，防止或減少后代的近親交配、建立科學(xué)可靠的遺傳系譜等，需要鑒定這些未知的父子關(guān)系。 張于光等（2005）利用10 對(duì)多態(tài)性引物對(duì)27 只東北虎進(jìn)行親子鑒定， 結(jié)果成功地鑒定出7 個(gè)父子關(guān)系不清的后代。 這表明利用微衛(wèi)星DNA 分子標(biāo)記可以有效的應(yīng)用于動(dòng)物的親緣關(guān)系的鑒定， 從而為有效地避免了近親繁殖帶來(lái)的種群遺傳多樣性降低的不良影響提供了理論依據(jù)。。

（五）評(píng)定棲息地的進(jìn)化保護(hù)價(jià)值

Fuller 等（1997）基于mtDNA 控制區(qū)（D-loop）序列分析， 研究了澳大利亞?wèn)|北部不同生態(tài)系統(tǒng)中的野兔種群的遺傳模式，結(jié)果表明：在干旱地區(qū)，各種群間存在廣泛的基因流，種群管理應(yīng)在整個(gè)干旱地區(qū)展開(kāi)；而在半干旱地區(qū)基因流很局限， 因此進(jìn)行再分割的局限地方性管理更加合理。 白素英等（2004）采用RAPD對(duì)中國(guó)豹貓6 個(gè)群體進(jìn)行遺傳多樣性分析，RAPD 聚類分析結(jié)果顯示：豹貓的遺傳變異相當(dāng)豐富，且各群體的遺傳變異相差較大。 6 個(gè)群體科分為4 支，黑龍江-山西為一支，對(duì)應(yīng)于北方亞種；貴州-廣西群體為另一支，對(duì)應(yīng)于指名亞種；云南群體為第三支，對(duì)應(yīng)于川西亞種；福建群體為第四支，對(duì)應(yīng)于華東亞種。 前三支遺傳多樣性相當(dāng)豐富，而福建群體遺傳變異較低。其原因可能是福建的地理位置特殊，一面臨海，三面環(huán)山，基因交流較少。 因此，建議豹貓的種群的管理應(yīng)在東北、西北、川西展開(kāi)，注意保護(hù)這三個(gè)地區(qū)種群的遺傳多樣性。 而對(duì)福建群體， 考慮基因流的影響應(yīng)進(jìn)行特殊管理。這正是用DNA 分子標(biāo)記來(lái)評(píng)定棲息地的進(jìn)化保護(hù)價(jià)值的意義所在。

二、前景與展望

現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)為我們提供了諸如RAPD、RFLP、AFLP、ISSR、SSR 等大量的可以在群體水平上分析遺傳多樣性的分子標(biāo)記， 微觀上的遺傳數(shù)據(jù)與宏觀上生態(tài)環(huán)境的變遷相結(jié)合， 使從機(jī)制上闡述了物種的保護(hù)途徑和方法。 為防止物種的滅絕，解決小種群遺傳多樣性損失和近交衰退問(wèn)題， 分析種群遺傳結(jié)構(gòu)和適應(yīng)潛力， 物種和群落的長(zhǎng)期保存等提供了有力的工具。 隨著分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展，DNA分子標(biāo)記的種類和數(shù)量將會(huì)不斷的增加， 技術(shù)會(huì)更加成熟。 目前在分析種群的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，確定種群的分類地位，尤其在解釋不同分類水平的關(guān)系方面，核基因是非常有用的， 如在各種鳥(niǎo)類群的分類和食肉目系統(tǒng)發(fā)生的研究中， 核基因已顯示它包含很多有價(jià)值的系統(tǒng)發(fā)生信息。因此，DNA 分子標(biāo)記正在發(fā)展使用線粒體DNA 和核基因序列數(shù)據(jù)相結(jié)合的標(biāo)記技術(shù)。

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