設(shè)計(jì)利用現(xiàn)代科學(xué)儀器 緊跟科學(xué)前沿的細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

薛雅蓉，莊 重，劉智慧

（南京大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，南京 210093）

2006年，國務(wù)院《國家中長期科學(xué)和技術(shù)發(fā)展規(guī)劃綱要（2006—2020年）》中提出，到2020年使我國進(jìn)入創(chuàng)新型國家行列。胡錦濤同志在2012年的全國科技創(chuàng)新大會(huì)上又重述了這一目標(biāo)。這都說明在我國的未來發(fā)展戰(zhàn)略中構(gòu)建創(chuàng)新型國家的目標(biāo)是勢(shì)在必行、勢(shì)在必得。

創(chuàng)新型國家建設(shè)需要?jiǎng)?chuàng)新型人才，而大學(xué)又是培養(yǎng)創(chuàng)新性人才的重要基地。在大學(xué)教育中，實(shí)踐／實(shí)驗(yàn)教學(xué)是培養(yǎng)創(chuàng)新型人才的重要環(huán)節(jié)。很難想象陳舊的實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容能夠培養(yǎng)出創(chuàng)新型人才。因此，需要廣大的實(shí)驗(yàn)教師和科技工作者設(shè)計(jì)出緊跟科學(xué)前沿發(fā)展的新實(shí)驗(yàn)教學(xué)項(xiàng)目，為創(chuàng)新人才培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。

科學(xué)儀器的發(fā)展能夠推動(dòng)科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，主要表現(xiàn)在拓寬了科學(xué)研究的領(lǐng)域，開拓了新的科學(xué)前沿［1］?？茖W(xué)儀器也是高校開展創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)必不可少的硬件條件，具有非常重要的作用。各個(gè)高校對(duì)這一點(diǎn)都已有明確的認(rèn)識(shí)并在不斷改善實(shí)驗(yàn)條件，使硬件條件不再成為限制開展創(chuàng)新型實(shí)驗(yàn)的羈絆。但僅有科學(xué)儀器是不夠的，教師必需關(guān)注學(xué)科的最新進(jìn)展，利用先進(jìn)的科學(xué)儀器開展創(chuàng)新型實(shí)驗(yàn)，將科學(xué)儀器真正轉(zhuǎn)變成輔助創(chuàng)新型實(shí)驗(yàn)教學(xué)的工具。

細(xì)胞生物學(xué)與我國現(xiàn)代生物產(chǎn)業(yè)發(fā)展的五大重點(diǎn)領(lǐng)域（生物醫(yī)藥、生物農(nóng)業(yè)、生物能源、生物制造、生物環(huán)保）都有交集和關(guān)聯(lián)，該領(lǐng)域涉及的檢測技術(shù)是整個(gè)生物領(lǐng)域的基礎(chǔ)和重要組成部分，在高校相關(guān)專業(yè)學(xué)習(xí)的大學(xué)生是這個(gè)領(lǐng)域未來的中堅(jiān)力量，了解和初步掌握這些前沿檢測儀器和手段對(duì)他們是十分必要的。這也是我們?cè)O(shè)計(jì)相關(guān)實(shí)驗(yàn)、并與同行交流的初衷。

1 細(xì)胞生物學(xué)現(xiàn)代科學(xué)儀器及其在細(xì)胞生物學(xué)研究中的應(yīng)用

用于細(xì)胞生物學(xué)研究的科學(xué)儀器很多，在這里只介紹目前比較先進(jìn)的幾種科學(xué)儀器，而對(duì)常規(guī)細(xì)胞生物學(xué)儀器如普通光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡及與其他學(xué)科交叉應(yīng)用較多的科學(xué)儀器，如電泳儀、電轉(zhuǎn)儀等不做介紹。

1.1 透射電子顯微鏡

在光學(xué)顯微鏡下無法看清小于0.2μm的細(xì)微結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)稱為亞顯微結(jié)構(gòu)（submicroscopic structures）或超微結(jié)構(gòu)（ultramicroscopic structures；ultrastructures）。要想看清這些結(jié)構(gòu)，就必須選擇波長更短的光源，以提高顯微鏡的分辨率。1932年，Ruska利用波長遠(yuǎn)小于可見光及紫外光的電子波（100kV的電子波的波長為0.003 7nm，而紫外光的波長為400 nm）作為光源，發(fā)明了透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM），以透過樣品的電子束來成像，使得細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)（各種細(xì)胞器結(jié)構(gòu)）得以清楚觀察［2］。

1.2 激光掃描共聚焦顯微鏡

激光掃描共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscopy，簡稱LSCM）是20世紀(jì)80年代在熒光顯微鏡基礎(chǔ)上發(fā)明的新型生物醫(yī)學(xué)圖像儀器。第一臺(tái)商品化的共聚焦顯微鏡由美國Biorad（伯樂）公司于1984年推出。它使用紫外或可見光激發(fā)熒光探針，并在熒光顯微鏡成像基礎(chǔ)上加裝了激光掃描裝置和計(jì)算機(jī)圖像處理系統(tǒng)，從而得到細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)和成分的熒光圖像［3－4］。

激光共聚焦顯微鏡在細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中不可替代的用途包括：

（1）構(gòu)建細(xì)胞三維圖像。LSCM在不損傷細(xì)胞的前提下，可產(chǎn)生組織細(xì)胞的光學(xué)切片，對(duì)活組織、活細(xì)胞不同層次進(jìn)行觀察和測量，所測數(shù)據(jù)儲(chǔ)存于計(jì)算機(jī)中，經(jīng)計(jì)算機(jī)圖像處理三維重建軟件重組，可得到標(biāo)本的三維立體結(jié)構(gòu)，揭示亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的空間關(guān)系。

（2）利用細(xì)胞器和細(xì)胞成分的熒光探針標(biāo)記特定細(xì)胞器與細(xì)胞成分后，可利用激光共聚焦進(jìn)行細(xì)胞器如線粒體、高爾基體，細(xì)胞成分如脂質(zhì)、蛋白、核酸、各種離子含量及存在部位的檢測、觀察。

（3）粘附細(xì)胞的直接分選。

1.3 流式細(xì)胞儀

流式細(xì)胞儀（flow cytometry，F(xiàn)CM）是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一種高科技細(xì)胞研究儀器，利用可見光或紫外光對(duì)通過儀器的細(xì)胞流進(jìn)行檢測分析。主要用途可歸結(jié)為兩個(gè)大的方面［5］：

（1）細(xì)胞測量與分析：它可以快速測量、存貯、顯示懸浮在液體中的分散細(xì)胞的一系列重要的生物物理、生物化學(xué)方面的特征參量，如細(xì)胞大小、細(xì)胞周期、細(xì)胞DNA倍體含量、細(xì)胞凋亡情況、抗原表達(dá)。

（2）細(xì)胞分選：可以根據(jù)預(yù)選的細(xì)胞參量范圍把指定的細(xì)胞亞群從中分選出來［6］。

流式細(xì)胞儀和激光共聚焦顯微鏡都可對(duì)細(xì)胞內(nèi)熒光標(biāo)記成分進(jìn)行分析，但前者卻只能測定單細(xì)胞的總量，不能分辨其分布位置。后者即可測定其含量，又可觀察其分布。

2 幾個(gè)細(xì)胞生物學(xué)研究前沿領(lǐng)域

細(xì)胞生物學(xué)研究的前沿領(lǐng)域包括細(xì)胞衰老及抗衰老、腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡 、干細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)分化 、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞基因沉默等。

2.1 關(guān)于細(xì)胞衰老的研究

細(xì)胞衰老（cellular senescence）是一個(gè)應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞生長停滯的生理過程。細(xì)胞衰老及抗衰老研究一直是細(xì)胞生物學(xué)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一，研究主要集中在衰老機(jī)制、引起細(xì)胞衰老的因素以及控制細(xì)胞衰老的方法［7］。

美國科學(xué)家Denham Harman 1956年提出了衰老的自由基學(xué)說，認(rèn)為生物體衰老過程中的退行性變化是由于細(xì)胞正常代謝過程中產(chǎn)生的自由基的有害作用造成的。體外利用過氧化氫誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生衰老樣變化的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了Harman的觀點(diǎn)。

無論從哪個(gè)角度研究衰老細(xì)胞，都需要首先對(duì)其進(jìn)行識(shí)別和確定?，F(xiàn)在最常用的方法為細(xì)胞衰老相關(guān)的β－半乳糖苷酶檢測［8］。這種β－半乳糖苷酶是一種與細(xì)胞代齡（即衰老程度）有關(guān)的酶，可在接近中性的條件下作用于其生色底物 X－gal（5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D－半乳 糖 苷，5－Bromo－4－Chloro 3－Indoly－（－D－Galactoside，X－gal）生成藍(lán)色不溶物。Dimiri（1995）提出將這種中性β－半乳糖苷酶作為體內(nèi)外細(xì)胞衰老研究的生物學(xué)標(biāo)志，可在反應(yīng)后用普通光學(xué)顯微鏡觀察研究。

有研究者用激光共聚焦顯微鏡觀察比較了正常和衰老的人二倍體成纖維細(xì)胞經(jīng)DAPI染色后的顯色差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在衰老細(xì)胞核中出現(xiàn)呈點(diǎn)狀聚集的特征性異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，被稱為衰老相關(guān)異染色質(zhì)灶（senescence－associated heterochromatinfoci，SAHF）［9］，該發(fā)現(xiàn)為識(shí)別衰老細(xì)胞提供了一個(gè)新的生物學(xué)標(biāo)志。

2.2 關(guān)于腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的研究

癌癥（cancer）是一種對(duì)人類健康甚至生命危害極大的疾病，是腫瘤細(xì)胞因增殖失控而大量增殖的結(jié)果。藥物抗癌是治療癌癥的重要途徑之一。其中通過干擾腫瘤細(xì)胞生長、代謝、增殖等過程并最終誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是抗癌藥物治療的理想途徑。檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)是了解藥物是否通過誘導(dǎo)凋亡機(jī)制抗癌、繼而尋找誘導(dǎo)凋亡的抗癌藥物的前提條件。

凋亡細(xì)胞在形態(tài)、細(xì)胞核、細(xì)胞膜、DNA完整性等方面都不同于正常細(xì)胞，比較典型的特征如細(xì)胞核染色質(zhì)凝集、邊緣化，細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸外翻，DNA從核小體處規(guī)律斷裂而使電泳呈梯狀條帶等。普通光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞儀及其他現(xiàn)代科學(xué)儀器在檢測細(xì)胞凋亡的這些現(xiàn)象中都可以發(fā)揮其各具特色的作用［10－11］。

2.3 干細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)分化

細(xì)胞分化是指同一來源的細(xì)胞逐漸產(chǎn)生各自特有的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理功能和生化特征的過程。關(guān)于細(xì)胞的誘導(dǎo)分化研究更多集中在誘導(dǎo)干細(xì)胞向所需細(xì)胞類型轉(zhuǎn)化，旨在為臨床移植治療及組織器官功能恢復(fù)治療奠定基礎(chǔ)［12－13］。

近年來細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域一個(gè)倍受關(guān)注的課題是腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)分化研究。其原理基于惡性腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的分化程度不同而導(dǎo)致生長及分裂速度不同，惡性腫瘤細(xì)胞為去分化細(xì)胞，生長及分裂速度遠(yuǎn)大于正常細(xì)胞。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞由去分化狀態(tài)恢復(fù)到分化狀態(tài)是惡性腫瘤治療的一個(gè)新途徑［14－15］。

被誘導(dǎo)分化的腫瘤細(xì)胞分裂速度減慢，可通過流式細(xì)胞儀準(zhǔn)確檢測細(xì)胞分裂指數(shù)得以顯示誘導(dǎo)是否成功。

2.4 細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是指細(xì)胞外信號(hào)分子作用于細(xì)胞受體（膜受體或胞內(nèi)受體）后引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的一系列生物化學(xué)反應(yīng)以及蛋白間相互作用，直至細(xì)胞生理反應(yīng)所需基因開始表達(dá)、各種生物學(xué)效應(yīng)形成的過程。與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的物質(zhì)包括受體、胞內(nèi)激酶、胞內(nèi)信使、轉(zhuǎn)錄因子等。調(diào)控這些物質(zhì)可以改變細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，引起細(xì)胞興奮或抑制，從而改變細(xì)胞功能。檢測細(xì)胞內(nèi)第二信使含量變化及信號(hào)蛋白磷酸化水平是檢測信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要方法［16］。激光共聚焦顯微鏡可以觀察胞內(nèi)鈣離子濃度的變化，信號(hào)蛋白磷酸化水平可通過蛋白電泳后的 Western blot（蛋白質(zhì)印跡）方法分析。其中Western blot中所用一抗為磷酸化蛋白對(duì)應(yīng)的抗體。

2.5 細(xì)胞周期調(diào)控

細(xì)胞周期（cell cycle）是指由細(xì)胞分裂產(chǎn)生新細(xì)胞的生長開始到下一次細(xì)胞分裂形成子細(xì)胞結(jié)束為止所經(jīng)歷的過程。

人為調(diào)控細(xì)胞周期，對(duì)于從理論上研究細(xì)胞周期的不同特點(diǎn)以及進(jìn)行植物多倍體誘導(dǎo)［17］、抗腫瘤研究和臨床應(yīng)用都有重要意義［18］。流式細(xì)胞儀在分析細(xì)胞周期方面非常有用［19］。

2.6 RNA干擾引起的細(xì)胞基因沉默

這主要指利用小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）引起細(xì)胞特定基因轉(zhuǎn)錄后特異性不表達(dá)。通過特異性的沉默基因，可實(shí)現(xiàn)研究特定基因功能、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長分化、封閉不良基因表達(dá)等［20－21］。RNA干擾引起的因基因沉默而表達(dá)蛋白水平下降通常通過蛋白電泳后的Western blot方法分析，如果是對(duì)細(xì)胞生長相關(guān)基因的沉默則可用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期的方法加以顯示。

3 利用現(xiàn)代科學(xué)儀器設(shè)計(jì)緊跟科學(xué)前沿的細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

3.1 細(xì)胞衰老的誘導(dǎo)與觀察

用雙氧水誘導(dǎo)培養(yǎng)的293T細(xì)胞或其他細(xì)胞產(chǎn)生衰老變化，然后用X－gal染色并用普通顯微鏡觀察衰老相關(guān)的β－半乳糖苷酶活性的變化；或用DAPI（4’，6－diamidino－2－phenylindole），對(duì)正常腫瘤細(xì)胞與發(fā)生衰老變化的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行染色后再用共聚焦顯微鏡觀察染色質(zhì)著色特征的差異。

3.2 腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡與檢測

用羥基喜樹堿等可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡變化的抗腫瘤藥物處理S－180腹水瘤細(xì)胞、Jurkat細(xì)胞，然后進(jìn)行不同處理后用普通光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞儀、電泳儀等檢測細(xì)胞發(fā)生的凋亡變化。

（1）普通光學(xué)顯微鏡觀察：制備細(xì)胞涂片，用瑞氏染液或吉姆薩（Giemsa）染液染色后在普通光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及染色質(zhì)的變化，以及是否形成凋亡小體等。

（2）電子顯微鏡觀察：制備細(xì)胞電鏡標(biāo)本，進(jìn)一步觀察染色質(zhì)的凝集及分布以及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的其他變化。

（3）激光共聚焦顯微鏡觀察：用 FITC－AnnexinV／PI對(duì)細(xì)胞進(jìn)行雙染色，染色后的細(xì)胞標(biāo)本用激光共聚焦顯微鏡觀察正常細(xì)胞、凋亡早期細(xì)胞、凋亡晚期細(xì)胞、壞死細(xì)胞的染色特征；

（4）流式細(xì)胞儀測定：用流式細(xì)胞儀將凋亡細(xì)胞、正常細(xì)胞、壞死細(xì)胞分開，統(tǒng)計(jì)凋亡細(xì)胞比率，檢測藥物誘導(dǎo)凋亡的效率。

（5）用電泳儀：提取細(xì)胞DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測凋亡細(xì)胞的特征DNA條帶，進(jìn)一步證明細(xì)胞發(fā)生的凋亡變化。

3.3 骨髓造血干細(xì)胞的分離及誘導(dǎo)分化檢測

可利用細(xì)胞磁分選儀及流式細(xì)胞儀分離大鼠骨髓CD34＋造血干細(xì)胞，然后用IL－3、IL－6、干細(xì)胞因子等細(xì)胞因子體外刺激其增殖后再與乳鼠心肌細(xì)胞共培養(yǎng)，使CD34＋造血干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化，發(fā)生分化變化的細(xì)胞用普通光學(xué)顯微鏡即可觀察。

3.4 腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)分化及檢測

維甲酸是一種腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)分化劑，可以在體內(nèi)及體外誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞由幼稚型向成熟細(xì)胞分化。因此，用含有維甲酸的細(xì)胞培養(yǎng)液在體外培養(yǎng)HL－60（人早幼粒白血病細(xì)胞系）細(xì)胞，可使細(xì)胞群中的中幼粒和晚幼粒細(xì)胞比例增多、細(xì)胞增殖活性下降。細(xì)胞分類計(jì)數(shù)可通過細(xì)胞涂片、瑞氏染液染色后普通顯微鏡觀察得以實(shí)現(xiàn)；細(xì)胞增殖活性可用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞分裂指數(shù)顯示。

3.5 細(xì)胞的激活及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子檢測

鈣離子是重要的細(xì)胞內(nèi)第二信使，當(dāng)胞內(nèi)游離鈣離子濃度升高至一定濃度時(shí)，便與鈣調(diào)蛋白結(jié)合，進(jìn)而影響和調(diào)節(jié)眾多細(xì)胞內(nèi)代謝活動(dòng)。細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高也是淋巴細(xì)胞激活和增殖過程中早期呈現(xiàn)的一個(gè)重要現(xiàn)象。因此，可用PHA（植物血凝素）或ConA（刀豆蛋白A）激活淋巴細(xì)胞，然后用鈣離子熒光探針Fluo－3對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熒光染色后用激光共聚焦顯微鏡觀察激活前后胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。

3.6 細(xì)胞周期調(diào)控及檢測

細(xì)胞周期蛋白Cyclins對(duì)細(xì)胞增殖有正調(diào)控作用，這種作用尤以cyclin D1為代表。正常情況下，cyclin D1在G1期是恒定的，其過量表達(dá)可導(dǎo)致G1縮短，細(xì)胞分裂速度加快，導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控，甚至形成癌變。用攜帶細(xì)胞周期蛋白D1的質(zhì)粒pRK5－CyclinD1轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的293T細(xì)胞，然后收集細(xì)胞并用PI染色后可用流式細(xì)胞儀檢測分析細(xì)胞周期中G1期，S期和G2／M期各時(shí)相的百分比。

3.7 RNA干擾沉默癌基因及腫瘤細(xì)胞增殖檢測

c－myc是永生性癌基因，在細(xì)胞的生長、繁殖、凋亡及分化中具有極重要的地位。合成針對(duì)c－myc mRNA的第1545－1565靶位點(diǎn)的siRNA，然后轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞，72h后收集細(xì)胞并用PI染色后可用流式細(xì)胞儀檢測分析細(xì)胞周期中G1期，S期和G2／M期各時(shí)相的百分比，借此顯示對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用。

4 結(jié)束語

總之，利用現(xiàn)代科學(xué)儀器，針對(duì)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)科發(fā)展前沿和熱點(diǎn)，開設(shè)大學(xué)細(xì)胞學(xué)創(chuàng)新型實(shí)驗(yàn)，不僅有助于提升學(xué)生對(duì)現(xiàn)代科學(xué)儀器及其在細(xì)胞學(xué)中的應(yīng)用的了解，掌握相關(guān)學(xué)科的基礎(chǔ)知識(shí)和實(shí)驗(yàn)技能，而且有助于提高學(xué)生綜合應(yīng)用現(xiàn)代儀器解決細(xì)胞學(xué)及其他相關(guān)學(xué)科的科學(xué)問題的能力。這種設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的思路也有望為其他學(xué)科實(shí)驗(yàn)、實(shí)踐教學(xué)環(huán)節(jié)開展創(chuàng)新型教學(xué)提供參考。

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